猪瘟强毒和疫苗株的环介导等温扩增检测方法.docx

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1、0、引言　　猪瘟(classicalswinefever，CSF)是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种具有高死亡率和高度传染性特征的疾病，对全世界的养猪业造成极大的破坏．CSFV是单股正链RNA病毒，基因组大小约为12．3KB，编码一个大的多聚体蛋白，蛋白酶将其裂解成12种蛋白，包括8种非结构蛋白(P7、Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)和4种结构蛋白(囊膜糖蛋白Erns、衣壳蛋白C、E1、E2)，其中，5'

2、-UTR、3'-UTR、NS5B基因序列比拟保守，而NS5B常用于CSFV基因分型．目前我国猪瘟的防控仍然采取疫苗免疫为主的策略，但是由于缺乏相应的血清学标志和配套的鉴别检测方法，使得通过抗体检测很难区分免疫弱毒和野毒感染，不利于猪瘟的净化．近年来猪瘟免疫失败常有报道，主要是由于免疫不当所造成的母源抗体干扰和免疫耐受，导致非典型猪瘟和慢性猪瘟，使猪瘟的防治更加复杂．目前，猪瘟病毒的检测方法主要有血清学诊断方法、病毒别离培养、动物接种试验、ELISA和RT-PCR等，但是，血清学诊断方法可能会出现一定的交叉

3、反响，难以区分CSFV、BVDV和BDV感染，也很难鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种;病毒别离培养和动物接种实验诊断周期长、操作繁琐、检出率低;RT-PCR需要昂贵的实验仪器，不适合基层使用．因此，需要建立一种快速、简便、适合基层使用的方法来鉴别猪瘟野毒感染和疫苗接种．环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新型核酸扩增技术，选用4～6条特殊引物(内向引物FIP/BIP、外向引物F3/B3和环引物LF/LB)识别靶序列6～8个特异性区域，具有

4、极高的特异性;然后利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，60～65℃恒温催化新链合成，从而使靶基因到达高效扩增的目的，30～60min即可获得109靶序列拷贝．LAMP扩增产物为一系列序列反向重复的茎环结构和多环花椰菜样结构构成的DNA片段混合物，并产生焦磷酸镁沉淀，因此可通过观察白色沉淀、荧光染料颜色变化、凝胶电泳或斑点杂交等判定结果．因此，LAMP反响特异性强、灵敏度高、快速准确、操作简单，同时对生物污染物的耐受性强，可有效克服PCR反响中常见酶失活的问题，在病毒、细菌、寄生虫等病原微生物的临床检测

5、中得到广泛应用．在CSFV的LAMP检测方面，根据猪瘟病毒5'-UTR、E2或NS5B基因保守序列设计LAMP引物，建立了检测CSFV或HCLV的LAMP检测方法，其敏感性比RT-PCR高10～100倍，与荧光定量PCR相当，但鉴别检测CSFV强毒和疫苗株RT-LAMP的报道还很少．因此，本文在分析CSFV全基因组序列的根底上，设计CSFV强毒和疫苗株的特异性LAMP引物，分别建立了CSFV强毒和疫苗株的LAMP检测方法，为我国猪瘟防控与净化提供技术支撑，对动物疫病感染的鉴别检测有重要意义．　　1、材料与

6、方法　　1．1毒株　　CSFV标准强毒株(shimen)由河南省农业科学院动物免疫学实验室提供，猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)购自哈尔滨维科生物公司，以及实验室保存的PRV、PCV2、PRRSV、JEV等毒株．　　1．2主要试剂　　BstDNA聚合酶(8U)，10×thermopol反响缓冲液，dNTPmixture，DL2000DNAmarker，ExTaqDNA聚合酶，Mg2+/Mn2+混合物，TRIzol，异丙醇，无水乙醇，氯仿，琼脂糖，DEPC，罗丹明B衍生物荧光指示剂由河南省农业科学院王德国老师

7、惠赠．　　1．3引物设计与合成　　参照GenBank中登录的CSFV标准强毒株(shimen、Alfort、Brescia、Glentorf等)，疫苗株(HCLV、ChineseC、Rimes等)、不同基因亚型的CSFV野毒株，BVDV和BDV的全基因组序列，利用DNAstar软件进行比对，系统比拟分析猪瘟强弱毒株的序列差异，确定鉴别检测的靶基因位于NS5B基因上，然后运用在线软件primerexplorerv4software作为辅助，设计一套分别针对猪瘟弱毒疫苗株与强毒的LAMP引物(包括2条外引物F

8、3/B3，2条内引物FIP/BIP，2条环引物LF/LB)，同时设计猪瘟强弱毒株的通用PCR引物(包括上游引物F和下游引物R，见表1)．【表１】　　1．4病毒RNA的提取及RT-PCR鉴定　　1．4．1RNA提取取稀释过的猪瘟活疫苗及shimen株300μL至灭过菌的1．5mL离心管中，用TRIzol试剂盒提取猪瘟病毒强毒株与兔化弱毒疫苗株的RNA，然后加13μLDEPC水溶解，用于RT-PCR反响．1．4．2RT-PCR依据