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1、第三章细胞生物学研究方法1第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜(lightmicroscopy)技术二、电子显微镜(Electromicroscopy)技术21.分辨率(resolusion)：区分两个质点间的最小距离。R=0.61λ/nsinα/2其中:n=标本和物镜之间介质折射率;λ=入射光线波长；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）nsinα/2称为物镜的数值孔径(numericalaperature,NA)R=0.61λ/NA思考题：如何提高显微镜的分辨能力？样品物镜α342.放大倍数(magnification):最终成像的大小与原物
2、体大小的比值。光学显微镜的最大放大倍数为1,000倍.电子显微镜的最大放大倍数为1,000,000.5一、光学显微镜（一）普通复式光学显微镜6（二）相差显微镜78Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandp
3、roduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.91.原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比。2.两个特殊构件：环状光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间。相位板（annularphaseplate）：涂有光吸收物质和相位推迟物质。3.用途：能观察无色、透明、活细胞中的结构。1932年P．Zernike发明，1953年,诺贝尔物理奖。101.原理：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。（三）
4、微分干涉显微镜11122.应用：适于研究活细胞中较大的细胞器、颗粒及其运动。计算机辅助的DIC分辨率比普通光镜提高了一个数量级。应用这一原理制备的录像增差显微镜（video-enhancemicroscopy）可以观察微管上颗粒的运动。13（四）荧光显微镜141.原理：以紫外线为光源照射被检物体，使之发生荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在的位置。2.特点：光源不直接照明，而是激发能源；需特殊的滤色镜；分辨率高。3.用途：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性、定位。既可以观察切片，也可以进行活体观察。有免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。
5、15Fluorescenceimageofepithelialneuroncell16Singapore’sNationalInstituteofEducationUKUniversityofFloridaFrenchSingaporeSouthKorea17（五）激光扫描共聚焦显微镜181.原理：激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描，获得样品不同层面的图像（称为光切片），再通过计算机组合成三维重构的影像。2.优点：分辨能力比普通光学显微镜提高1.4-1.7倍。3.用途：类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像，在研究亚细胞结构与组分方面广泛
6、应用。19laserconfocalscanningmicroscope,LCSM2021（六）倒置显微镜221.特点:物镜与照明系统颠倒。2.用途:用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。23(七)荧光共振能量转移技(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,检测某一细胞中两个蛋白分子是否存在直接的相互作用。24490nm荧光供体（CFP）430nm激发光受体（YEP）25受体（YEP）490nm荧光供体（CFP）430nm激发光
7、530nm黄色荧光FRET26(八)荧光漂白恢复技术27暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜.背景黑,物体的边缘亮,增大反差,提高分辨率.主要观察轮廓,适于观察活细胞内的细胞核、线粒体液体介质中的霉菌等。28（九）当代显微镜的发展趋势采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。291932年德国学者MaxKnolls和ErnstRuska用波长比光短得多的电子作光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开
8、拓了超微世界。光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构（submicroscopicstructu
