组织细胞原位凋亡实验.docx

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1、.....................最新资料整理推荐.....................TUNEL法测凋亡操作步骤一、TUNEL检测原理TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位D

2、NA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（TerminaldeoxynucleotidylTransferaseBiotin-dUTPNickEndLabeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。二、试剂盒组份组份10ass

3、ays25assays储存条件A：EquilibrationBuffer1.0mL2.5mL-20℃5.....................最新资料整理推荐.....................B：BiotinylatedNucleotideMix10μL25μL-20℃C：TdTEnzyme10μL25μL-20℃D：500×ProteinaseK10μL25μL-20℃20×SSC15mL38mL4℃E：Streptavidin-HRP10μL25μL4℃F：20×DABSubstrateBuffer5

4、0μL125μL4℃G：20×DABChromogen50μL125μL4℃H：20×HydrogenPeroxide50μL125μL4℃三、操作流程1.操作流程概览2.细胞样本制备准备：●PBS：8.0gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。●固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；●封闭液：3%H2O2溶于甲醇；●细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；操作步骤：1)

5、经过实验处理的细胞爬片或细胞涂片，自然晾干；5.....................最新资料整理推荐.....................2)室温固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；3)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min；4)浸入细胞膜通透液中，室温30sec~2min；5)进行标记反应。3.石蜡包埋组织切片预处理准备：●石蜡切片脱蜡至水：二甲苯脱蜡2×10min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）；●蛋白酶K工作液：2μL500×蛋白酶K+998

6、μLPBS；●固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；●封闭液：3%H2O2溶于甲醇。操作步骤：1)石蜡包埋的组织切片按常规方法脱蜡至水；2)PBS漂洗3×5min；3)加入蛋白酶K工作液，37℃反应15~30min；PBS漂洗3×5min；4)（选择进行）室温固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；5)浸入封闭液中，室温封闭10min，PBS漂洗3×5min；6)进行标记反应。4.冰冻组织切片预处理准备：●固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；●封闭液：3%H2O2溶

7、于甲醇；●细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；操作步骤：1)冰冻切片浸入固定液，室温固定10min；PBS漂洗3×5min；2)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min；5.....................最新资料整理推荐.....................3)浸入通透液中，室温30sec~2min；4)进行标记反应。5.阳性对照和阴性对照的准备TUNEL检测时需要设立阳性对照和阴性对照，以显示实验的客观性和准确性。1)阳性对照样本的处理（选择进行）DNa

8、seI反应液（用户自备）：（10U-3000UDNaseI；40mMTris-HClpH7.9；10mMNaCl；6mMMgCl2；10mMCaCl2）组织样本经过蛋白酶K处理或者通透液处理，PBS浸洗后，加入100μLDNaseI反应液，室温孵育10~30min，用去离子水彻底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，进行标记反应。2)阴性对照样本的处理在进行标记