原位杂交与凋亡检测技术

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1、原位分子杂交技术原位杂交(insituhybridization,ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记的核酸探针与组织、细胞中的待测的核酸按碱基配对的原则进行特异的结合而形成杂交体。再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带有颜色的杂交信号，在显微镜下进行细胞内定位。DNA---DNA;RNA---DNA;RNA---RNA人工合成寡核苷酸---DNA(RNA)常用方法：膜上杂交：用醋酸纤维膜和尼龙膜等作为载体，将靶基因转移到膜上，然后用探针进行杂交，阳性结果显示为条纹或斑点。液相杂交：以生物素或丫啶翁酯

2、标记探针在溶液中用羟基磷灰石层析或吸附、亲和吸附、磁珠吸附等方法进行杂交，结果于计数器，光度计或用化学发光测定。原位杂交：在具有明确的结构基础上，如一个细菌，一条染色体，细胞或组织上进行核酸杂交，可以检测到特定基因的准确定位。原位杂交技术的出现是组织化学和免疫组织化学的革命性突破。一、原位杂交的分子生物学基础：（一）核酸的分子结构：C、H、O、N、P*核酸→水解→多聚核苷酸→水解→核苷、磷酸→水解→戊糖、含氮碱（碱基）、磷酸。（二）核酸的一级机构：碱基共同成分：腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)；区别：DNA含有胸腺嘧啶(T)；RNA含有尿

3、嘧啶(U)。（三）核酸的高级结构：根据碱基配对规律DNA：多核苷酸链可形成双螺旋三、四股螺旋；但有高温变性，低温复性的特点。RNA：多核苷酸链一般以单链存在，仅有时局部形成小双螺旋结构。二、原位杂交的发展史：1、1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首创用爪蟾核糖体基因探针与卵母细胞杂交，杂交点定位于核仁。同年，Buongiorno-Nardelli等用同位素标记核酸探针对细胞和组织进行定位。2、1970年Orth用3H标记兔乳头状瘤病毒cRNA探针在冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出细胞中的病毒DNA。3、1981年Bauman应用

4、荧光素标记cRNA探针，在荧光显微镜观察成功。4、1983年Brigat首建生物素标记的探针在组织切片上检出病毒DNA.5、1987年Biochemisca推出地高辛标记的试剂及药盒。三、核酸探针的分类：按标记方法分：1、放射性探针：用放射性同位素32P、35S、3H标记，通过放射自显影方法显示。特点：灵敏度高，辐射危害，耗时久，半衰期限制。2、非放射性探针：用FITC,Biotin,DIG,HRP,AP标记，用相应的检测系统显示。特点：灵敏度也高，安全，快速，广泛应用。按探针的性质分：1、DNA探针：双链：采用PCR方法，从基因库钓取或人工合成

5、。单链：将DNA片段装载到质粒或菌体中，以此为模板用Taq酶合成互补单DNA探针或以RNA为模板，用反转录酶合成单链cDNA探针。特点：双链长度较长（数百~数千个硷基），信号强，但渗透性差。单链较好。2、RNA探针：一般为单链；采用体外转录技术（单向或双向），用新型载体pSP和pGEM，在SP6RNA或T7RNA聚合酶作用下进行RNA转录而成。特点：长度随意，稳定，信号更强。3、寡核苷酸探针：已知基因序列，由核酸合成仪合成。特点：链短，杂交速度快，特异性强，价廉质稳。四、原位杂交技术的应用：1、基因芯片（基因组图）；2、基因表达定位；3、转基因检

6、测。4、核DNA和RNA的mRNA的排列和运输，复制和细胞分类5、细胞遗传学、产前诊断、肿瘤诊断6、病毒学和病原学、传染性疾病的诊断7、生物学剂量的测定五、原位杂交技术的基本方法：包括：1、杂交前准备：固定、取材、玻片和组织处理，增强核酸探针的穿透性，减低背景染色等。2、杂交：3、杂交后处理：4、显示：放射自显影，组化或免疫组化显色。（一）固定：DNA较稳定，mRNA次之，RNA最易被酶降解。固定液：(1)4%的多聚甲醛（加1/1000DEPC）(2)冰醋酸酒精(3)Bouin固定剂(4)冰冻切片直接在(1)液10min（二）玻片处理：载玻片经热

7、肥皂水刷洗---清洁液浸泡24h----95%酒精浸泡24h---蒸馏水冲洗----1500C以上烘箱过夜。玻片粘附剂：多聚赖氨酸，APES。盖玻片应做硅化处理。（三）防止RNA酶污染：1、整个实验过程均需戴消毒手套。2、实验用玻璃器皿在实验前一日置高温（2400C）烘烤，以破坏RNA酶。（四）、增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：1、TritonX-1002、蛋白酶K（ProteinaseK1ug/ml）370C15~20min3、胃蛋白酶（Pepsin20~100ug/ml）370C30min上述酶消化后用4%多聚甲醛后固定。（五）减低背景染

8、色1、乙酸酐和三乙醇胺浸洗，以减低静电效应。2、杂交后酶处理。3、杂交后洗涤。（六）预杂交：用不含探针和硫酸葡聚糖的液体封闭非特异性杂交