贝类派琴虫原位杂交检测技术研究.pdf

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1、分类号S855.9学校代码10129UDC11.593.1学号08201079贝类派琴虫原位杂交检测技术研究StudyonInSituHybridizationDetectionMethodofClamPerkinsusInfection申请人：王宗祥学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：兽医寄生虫学与寄生虫病学指导教师：杨晓野教授吴绍强副研究员论文提交日期：二〇一一年五月摘要派琴虫病（Perkinsosis）是严重危害全球贝类养殖业的主要疫病，也是进出口贝类产品贸易中的重要检疫性疫病，目前，世界动物卫生组织（OIE）将雷氏液体巯基醋酸盐培养基（RFTM）培养法

2、作为派琴虫（Perkinsus）检测的金标准，但其不能区分腰鞭毛虫（Dinflagellate）；另外，鉴于我国口岸检疫现阶段普遍采用的PCR检测方法存在假阳性率过高的缺陷；本研究通过采用随机引物标记法，制备派琴虫特异性核酸探针，首次建立了派琴虫原位杂交(ISH)检测方法。探针标记效率检测表明，所制备派琴虫核酸探针含量达到100ng/µL；Southernbolt检验证实探针特异性强，与贝类包拉米虫（Bonamia）、单孢子虫（Haplosporidium）等无交叉反应，为派琴虫属通用探针；以OIE推荐的雷氏液体巯基醋酸盐培养基培养法作为标准方法，对实验室采集的20份

3、贝类样品进行派琴虫感染检测表明，本研究所建立派琴虫原位杂交检测方法的诊断敏感性为90.9%，诊断特异性为100%。利用所建立的原位杂交方法，对实验室采集的蛤仔和牡蛎进行检测的结果显示，我国黄海海域的菲律宾蛤仔和文蛤均有派琴虫感染，而牡蛎样品没有检出。贝类派琴虫原位杂交检测方法的成功建立，既满足了我国口岸进出境贝类派琴虫检疫需求，也为我国贝类养殖场派琴虫流行病学调查提供了技术支持。关键词：派琴虫；核酸探针；RFTM培养；原位杂交；检测StudyonInSituHybridizationDetectionMethodofClamPerkinsusInfectionAbst

4、ractPerkinsusinfectioncanbringgreatdamagetoshellfisheryandcausesignificanteconomiclosesintheworld,soitisanimportantquarantineloimia.RayFluidThioglycolateMedium(RFTM)assayisagoldstandardrecommandedbytheOfficeInternationalDesEpizooties（OIE）todectectthePerkinsusinfection,butitcan’tdifferen

5、tiateDinoflagellatewithPerkinsusastheformerhassimilarcharacterswithlaterafterculturedinRayFluidThioglycolateMedium(RFTM).Besides,thePCRassayusuallyappliedinentry-exitinspectionofChinahasahighfalsepositiverate.Inthisstudy,Insituhybridization(ISH)methodtodetectPerkinsuswasestablishedbyusi

6、ngrandomprimertoprepareDigoxigenin(DIG)-labeledPerkinsusprobeforthefirsttime.ThedetectionofDigoxigenin(DIG)-labeledPerkinsusprobecontentratewasupto100ng/µL.Bysouthernblottinganalysis,theprobewasspecificenoughtodistinguishPerkinsusfromBonamiaandHaplosporidiumanditwasauniversalprobewhichc

7、ouldbeusedinPerkinsusdetection.ComparedwithRFTMassay,20samplesofmolluscsweredetectedbythedevelopedISHassay.Itsdiagonosissensitivityandspecificitywere90.9%and100%,respectively.ShellfishsamplescollectedfrombaysoftheHuanghaiSea,includingRuditapesphilippinarum,Meretrixlusoria,Cycli