海产贝类派琴虫免疫荧光检测技术研究

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1、分类号S855.9学校代码10129UDC590学号2009201089海产贝类派琴虫免疫荧光检测技术研究StudyonImmunofluorescencetechniqueDetectionMethodofClamPerkinsusinfection申请人：王小环学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：兽医公共卫生指导教师：杨莲茹教授吴绍强副研究员论文提交日期：二〇一二年五月摘要派琴虫（也称为帕金虫，英文名称Perkinsus）是影响世界海产贝类养殖和发展的主要病原之一，在世界各地广泛流行。其精典的检测方法为巯基醋酸盐培养基(FTM)培养，

2、但该方法相对耗时，培养方法也比较复杂，仍需要其它辅助方法方可确定为阳性虫体。为了满足对派琴虫快速、准确的检测需求，本研究制备了派琴虫特异性抗原及其相应的特异性单克隆抗体，并在此基础上建立了派琴虫免疫荧光检测方法。根据GenBank公布的派琴虫CB5D4细胞壁蛋白基因序列设计并合成引物，成功扩增出派琴虫CB5D4基因，并运用分子克隆方法构建了派琴虫CB5D4-pMD19Tsimple质粒，将CB5D4基因与原核表达载体pET32a连接后，转入BL21(DE3)感受态细胞中获得表达菌种，经IPTG诱导并表达后，通过SDS-PAGE检测，结果表明，该基

3、因编码的蛋白以可溶形式表达。将该蛋白纯化后免疫小鼠，运用单克隆抗体技术进行细胞融合、亚克隆、克隆、建株后，共筛选出6株抗派琴虫细胞壁蛋白的单克隆抗体细胞株，将该6株细胞分别命名为1E11、1B5、1B6、2A10、3B5和4E5，为相关免疫学检测方法的研究建立奠定了基础。将纯化的单克隆抗体标记FITC荧光素后，应用直接免疫荧光技术对试验室FTM培养的派琴虫及疑似感染派琴虫的蛤仔石蜡切片进行检测，成功建立了派琴虫免疫荧光检测方法。关键词：派琴虫；CB5D4；单克隆抗体；免疫荧光；检测StudyonImmunofluorescencetechniqu

4、eDetectionMethodofClamPerkinsusinfectionAbstractPerkinsusinfectionofoysterscanhaveseverepathogeniceffectonitshostsanddestroyedtheoysterindustriesinseveralcountries.RayFluidThioglycolatemedium(RFTM)cultureassayastheClassicaldectionmethodmayhavetime-consumingandculturecomplex,s

5、tillneedtootherauxiliarymethodcandeterminethepositivePerkinsus.TomeettheFastandaccurate,thisstudywasproducedspecificantigenanditscorrespondingspecificmonoclonalantibodies,andonthisbasis.TheimmunofluorescencetechnologywasselectedtodetectPerkinsussp.inclamsandoysters.Accordingt

6、opublishedGenbankPerkinsusmarinusCB5D4cell-wallprotein(MOE)genesequencedesignedandsynthesizedprimers,CB5D4genewasamplifiedfromPerkinsusmarinusgenomicDNA.ACB5D4-pMD19TsimpleplasmidforthedetectionofPerkinsusmarinusbasedonCB5D4hasbeendeveloped.CB5D4wasligatedtoexpressionvectorpE

7、T32aandtransformedintoBL21(DE3)Escherichiacoli,andinducedtoexpressbyinducingwithIPTG.bymeansofSDS-PAGEandWesternBlotanalysis.Theresultsindicatedthattheproteinwasexpressedasasolubleprotein.Thepurifiedproteinwasusedtoimmunizethemouseandcellfuse,detecting,selecting,colonizingand

8、soon,weproduced6specificmonoclonalantibodiesagainstPerkinsusmarinusa