牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及贝类派琴虫流行病学调查

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1、学校代码：10264研究生学号：M120101084上海海洋大学硕士学位论文牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩题目：增检测方法的建立及贝类派琴虫流行病学调查TheestablishmentofCPAtechniquesindetectingOsHV-1-SBand英文题目：epidemiologicalsurveyofPerkinsussp.inShellfish专业：水产养殖学研究方向：病原微生物检测姓名：赵小金王崇明研究员指导教师：蔡生力教授二O一五年四月十三日I上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明

2、：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学

3、位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日II上海海洋大学博/硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注主席委员委员秘书答辩地点答辩日期IV牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及贝类派琴虫流行病学调查摘要牡蛎疱疹病毒魁蚶株（SBstrainofOstreidherpesvirus-1，OsHV-1-SB）是由2012年6

4、月本实验室从山东长岛、莱州、日照和即墨等地的养殖基地魁蚶样品中检测获得，其感染健康魁蚶后，主要表现为反应迟钝、触碰后双壳不闭合或闭合缓慢，外套膜内缩，内脏团呈灰白色或黑灰色。出现上述症状的个体一般1d内就会死亡，其死亡率可达到75%，目前关于该病毒的有效检测方法尚未建立。本论文根据本实验室已测序完成的OsHV-1-SB全基因组序列，运用交叉引物等温扩增（crossprimingamplification，CPA）技术，通过对反应条件的优化、CPA产物的酶切鉴定、CPA灵敏度实验、CPA特异性实验和实际样品的

5、检测，为OsHV-1-SB建立了一种现场简单、快速、高灵敏度的检测方法。同时，运用聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR）技术对2010年全年实验室采集贝类样品中派琴虫感染情况进行了流行病学调查，以期为派琴虫的有效防控提供一定的理论依据。研究方法和部分结果如下：第一部分：根据本实验室已测序完成的OsHV-1-SB全基因组序列（文未发），选择其保守区域作为CPA反应的靶序列，使用PrimerExplorer4.0引物设计软件，设计出一套CPA反应引物，并对2+反应体系的温度、d

6、NTPs和Mg浓度和反应时间进行了优化。结果I显示，最佳温度为63℃，反应时间为60min，dNTPs浓度为1.42+mmol/L，Mg浓度为6mmol/L。该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA，并且特异性较强，与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应。并使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、辽宁大连共计22份OsHV-1-SB感染情况未知的魁蚶样品进行了检测。研究表明，实验所建立的OsHV-

7、1-SB的CPA检测方法简单、快速、灵敏且特异性强。由于其检测结果可通过简单离心观察白色沉淀或者向反应管中加入TM核酸荧光染料GeneFinder通过颜色变化进行阴阳性判断，所以可以在沿海条件简陋的贝类养殖厂及实验室使用，具有较好的应用前景。第二部分：派琴虫是危害贝类养殖业的主要寄生虫，实验通过对2010年全年采自山东青岛、山东荣成、山东长岛、广东惠安和福建霞浦的共计548份贝类样品，提取核酸后使用OIE推荐的PCR检测方法对派琴虫进行了检测。结果显示，全部样品中奥尔森派琴虫的阳性率达到了21.17%，其中

8、青岛流清河贝类样品中栉孔扇贝（蓬莱红和野生苗）阳性率为22.00%，贻贝阳性率为55.00%；荣成桑沟湾栉孔扇贝（蓬莱红、野生苗和人工苗）阳性率为16.30%，贻贝阳性率为18.52%；烟台长岛县贝类样品阳性率较低，只有皱纹盘鲍检测到阳性，栉孔扇贝野生苗和虾夷扇贝中均没有检测到奥尔森派琴虫。同时，对各月份采集贝类样品奥尔森派琴虫的整体阳性比率进II行汇总分析，结果显示，奥尔森派琴虫感染主要发生在夏季水温较高季节，