原位细胞凋亡检测改良方法的比较

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1、原位细胞凋亡检测改良方法的比较【摘要】目的:探讨TUNEL法检测细胞凋亡的最佳条件。方法:利用9例标本45张组织切片进行凋亡检测，分别单纯和组合使用蛋白酶K消化、微波修复和TritonX100前处理方法并作比较。结果:蛋白酶K合并微波及TritonX100组（++）阳性率为89%，蛋白酶K合并微波组（++）阳性率为67%，蛋白酶K合并TritonX100组（++）阳性率为44%，单纯蛋白酶K及微波组（++）阳性率均为11%。将组合处理组与单纯处理组比较，P<0.01，差异有显著性。结论:蛋白酶K消化、

2、微波及TritonX100多重组合的检测前处理方法可以明显提高杂交信号阳性敏感度。【关键词】细胞凋亡；蛋白酶K；微波　　细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡，是一种受基因控制的主动性细胞自杀过程，肿瘤的发生、发展和转归都与细胞凋亡有密切的关系［1］。原位凋亡检测是近些年发展起来的细胞凋亡检测技术，目前广泛采用的是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术。凋亡率的高低与患者预后也有着直接的关系，现已成为评价疗效的重要指标之一［2］。本文应用蛋白酶K消化、微波、和Tri

3、tonX100不同的前处理方法，进行凋亡检测的改良和比较，以提高检测阳性率，正确反映机体细胞凋亡的实际水平。　　1材料与方法　　1.1主要试剂及设备Roche公司生产的AP原位细胞凋亡检测试剂盒（Cat.NO.11684809910）；微波炉（y，HE染色一张，余作凋亡染色。设计蛋白酶K组、微波处理组、蛋白酶合并微波组、蛋白酶合并TritonX100组、蛋白酶合并微波及TritonX100组，每组设阴性对照2张。　　1.3方法　　1.3.1前处理组织切片脱蜡至水，蒸馏水洗。蛋白酶K组：滴加PBS稀释的蛋白

4、酶K（20μg/ml），37℃孵育20min，PBS冲洗终止反应。微波组：将切片置于200ml0.01MpH6.0枸橼酸缓冲液中微波处理8min,370pH7.4PBS缓冲液漂洗3次，再滴加碱性磷酸酶（AKP）标记的抗荧光素抗体，37℃孵育30min，PBS漂洗3次，NBT/BCIP避光显色约10min，镜下观察，适时终止反应，晾干后用水溶性胶（AECGLY）封片。　　1.3.3结果判定以细胞核阳性为判定标准，并结合HE染色，对HE染色证实为坏死的细胞不记数。在相同组织切片5个高倍视野记数各组间阳性细胞百分比，

5、凋亡细胞阳性率<5%为(-),5%～25%(+),25%～50%(++),>50%(+++)。　　1.3.4统计处理计数资料用百分比表示,数据的统计及分析使用SPSS12.0统计软件。　　2结果　　凋亡阳性细胞核呈深紫褐色，阴性细胞核不着色（见图1～图4）。各组切片比较，以蛋白酶K合并微波处理及TritonX100组阳性敏感度最高，蛋白酶K合并微波组次之，单纯蛋白酶K及微波组最低。各组阳性细胞敏感度百分比见表1，差异有显著性意义（P<0.01）。　　表1不同的前处理方法凋亡检测阳性敏感度比较（

6、略）　　注：A组与B组或C组比较，P<0.01。　　图1A组APTUNEL200（略）　　图2B组APTUNEL200（略）　　图3C组APTUNEL200（略）　　图4D组APTUNEL200（略）　　3讨论　　TUNEL技术作为一种比较成熟的凋亡细胞染色方法已被广泛采用,但如何提高染色的特异性和敏感性还存在一些问题。应用TUNEL法检测细胞凋亡时，染色的结果常常受到多因素的影响,如组织的自溶、固定剂的类型、固定包埋时造成的DNA损伤,染色过程中试剂的浓度、作用的时间等均是影响染色成败的关键。目前

7、的凋亡检测多采用蛋白酶K或胰蛋白酶等单一的前处理方法，对于石蜡标本的染色阳性度和敏感度普遍不高,容易出现假阳性和假阴性,因此，在进行组织切片的原位检测时，对组织切片进行预处理是必要的［3］，可以提高该方法的敏感性和消除假阳性及非特异性染色，但试剂说明及