细胞凋亡与增殖的原位检测

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1、细胞增殖与凋亡的原位检测技术一、细胞增殖活性原位检测技术细胞增殖(cellproliferation)是细胞数量的增加，其快慢即为增殖活性。①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。②S期(synthesisphase)，指DNA复制的时期，③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosisordivision)，细胞分裂开始到结束。细胞周期图G0期细胞：细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期依据细胞的分

2、裂能力，机体的细胞分为三类：不稳定细胞(labilecells)，持续分裂细胞稳定细胞(stablecells)，静止细胞处G0期永久细胞(permanentcells)，不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞根据细胞周期将细胞群分为两类分裂细胞指进入G1期后进行分裂的细胞；非分裂细胞是指处于G0期细胞及非增生的终末细胞。肿瘤细胞群也如此。增殖分数或生长分数分裂细胞与细胞总数之比值。生长分数值越大，增殖活性越高。测定生长分数能判断细胞群的增殖活性，即增殖快慢。生理状态下：不稳定细胞、稳定细胞呈现着活跃或较活跃的增生，补

3、充因凋亡而丧失的细胞，保持机体、器官或组织细胞数量的动态平衡。病理状态下：反应性增生组织细胞损伤或炎症刺激等均可引起细胞增生；肿瘤性增生肿瘤的本质是细胞增生紊乱所致。即使去除刺激因素，瘤细胞仍可持续增生。原位研究细胞增生活性，不仅涉及生理性及反应性细胞增生，更多是研究肿瘤细胞的增生活性。（一）原位检测细胞增生活性的常用方法及注意事项测定细胞增生活性的方法有：核分裂像计数Feulgen染色后显微分光光度法免疫组织（或细胞）化学技术显示与细胞增生与分裂相关的抗原嗜银核仁组织区法(argyrophil-stainednucleolaro

4、rganizerregionAgNORs)3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺入标记技术溴脱氧尿嘧啶核苷（胸腺嘧啶脱氧核苷相似物）标记技术流式细胞术测定S期细胞分数1.核分裂像计数核分裂像是人们可直接识别的细胞周期不同阶段的唯一细胞形态。因此，用光学显微镜就能进行计数。核分裂像计数有两种方法高倍视野法（HPF）一般在400倍放大下，随机选择一定数量（10个或更多）的HPF，分别观察并计数其中的核分裂像，最后算出平均每个HPF中的核分裂像数。核分裂指数（MI）测量时，可在显微镜目镜内放置网格测微尺，随机选择一定数量的视野，计数不同区域一定数量

5、的网格内核分裂像数，最后算出占所测细胞总数之比例，实质上，也是一种生长分数。注意事项：严格控制切片厚度在较厚的切片观察时，微调显微镜可在不同平面计数核分裂像，与较薄切片相比，显然增加了计数机会。组织标本固定时间若组织不及时固定，细胞仍有分裂机会，也会增加核分裂计数可能性。切片不能过染切片过染会导致核分裂像辨认困难。用同一台或HPF面积相同的显微镜计数2.免疫组织（或细胞）化学方法通过染色细胞增生相关的核蛋白判断细胞的增生活性。Ki67因其所测的蛋白只表达在G1，G2，M和S期的细胞，G0期及G1早期细胞不表达。PCNA是针对增殖细

6、胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）的抗体。在除G0期外的其它时相细胞均可测出。但水平不一，G1期迅速增加，G1/S交界期达高峰，S期维持高水平，G2期开始下降，G1早期和M期表达水平最低。MCM蛋白（微染色体维持蛋白）是启动DNA复制和延伸的关键蛋白。只在具有增殖潜能和增殖细胞中表达。可显示整个细胞周期细胞。DNA拓扑异构酶Ⅱa是一种核酶，参与DNA复制、基因转录、染色体聚集及催化有丝分裂和减数分裂的染色体分离，在细胞增殖中其重要作用。细胞周期中不同时期的关卡蛋白或调节元件细胞周期

7、素A、B、C、D、E周期素依赖性激酶（CDK）Ki67或PCNA抗原在核内表达．故增生细胞的核呈棕色或红色，用苏木素衬染也能清楚区分阳性与阴性细胞。Ki67Ki67肠腺瘤肠腺癌Ki67Ki67PCNAPCNAPCNAKi67LI，PCNALI采用计数核分裂像的方法，计数并算出标记细胞与所测细胞总数之比，称为标记指数（1abellingindex，LI），也是一种生长分数。肠腺瘤肠腺癌3.DNA含量测定正常体细胞含二倍体基因组DNA。S期的DNA合成使细胞遗传信息增加。并可出现二倍体以上甚至四倍体DNA。因此，能测量DNA含量的方法

8、，如胸腺嘧啶标记、溴脱氧尿核甙掺入、流式细胞术及Feulgen染色后均可测定细胞的DNA含量，但能在原位检测者，是Feulgen染色后显微分光光度计或计算机图像分析，Feulgen染色测定时以组织中的静息淋巴细胞DNA含量为二倍体对照。与所测细胞比