原位肝移植缺血再灌注损伤对大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响

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1、原位肝移植缺血再灌注损伤对大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响作者：李波江淼禹化龙刘佳宁高壮雷胡三元【摘要】目的对比研究大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤对肾脏组织细胞凋亡的影响。方法参照Kamada“二袖套法”，建立Wistar大鼠原位肝移植动物模型，并以假手术组大鼠为对照组。分别于术后1、3、6、12、24h处死两组动物，检测血清尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)水平变化。应用免疫组化(SP)法检测肾脏凋亡细胞的Fas蛋白表达，应用流式细胞技术检测肾脏细胞凋亡。结果肝移植组及对照组中BUN及CREA从术后1h开始上升,12h时达到高峰。两组肾脏组织细胞术后1h即出现细胞凋亡，12h时达到高峰

2、。结论原位肝移植缺血再灌注损伤可致肾脏细胞凋亡，是肾脏细胞早期死亡的主要形式。【关键词】原位肝移植;缺血再灌注损伤;细胞凋亡;肾脏原位肝移植作为终末期肝病的有效治疗手段正得到广泛的应用，随着高效、强力免疫抑制剂的广泛应用，急性免疫排斥反应的发生率已明显降低。但是，肝移植病人术后出现急性肾衰竭者逐渐增多，其发生机制是什么?变化规律又是怎样?国内外尚无文献报道，本文就此问题进行探讨。7　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1动物健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，重200～250g，购自山东大学实验动物中心。　　1.1.2分组随机分为肝移植组及对照组，每组30只。分别于术后

3、1、3、6、12h和24h处死大鼠，每个时间点每组6只。　　1.1.3动物模型制作肝移植组：采用Kamada法〔1，2〕建立大鼠的原位肝移植模型。对照组：乙醚开放麻醉，上腹部正中切口进腹，切断肝上部与膈肌相连之韧带，游离肝十二指肠韧带。游离肝下腔静脉(IVC)，剪开覆盖在IVC上的腹膜，游离右肾上腺静脉，结扎并剪断。再剪断肝左叶与膈之间的韧带，显露左膈静脉及左肝与食管间血管，结扎1次，关腹。　　1.1.4标本处理以上两组动物乙醚麻醉后，行腹部大十字切口进腹，于肝下腔静脉抽取静脉血2.0ml，迅速注入生化试管中。再切取右肾组织，一半组织迅速放入液氮中保存，另一半组织用10%甲醛固定

4、，石蜡包埋备用。7　　1.2方法　　1.2.1肾功能检查用全自动生化分析仪检测各组大鼠术后1,3,6,12h和24h血浆中尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)水平。　　1.2.2免疫组化检测肾脏细胞Fas表达的免疫组化检测采用免疫组化(SP)法检测，按照试剂盒说明书进行操作。结果判断:阳性细胞为胞浆染色呈黄色或棕黄色。参照文献〔3〕，用Imageproplus(MediaCybernetics公司，美国)专业图像分析软件系统进行免疫组织化学定量研究:通过显微镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统内。每只大鼠取5张切片，每张切片随机选择10个视野，10个视野测试面积作为包容空间，

5、将肝细胞Fas表达的阳性面积除以包容空间，取其均值作为阳性区域面积(阳性面积的百分率)作为表达指数(positiveexpressindex，PEI)。　　1.2.3细胞凋亡检测采用流式细胞术(Flowcytometry，FCM)DNA含量分析法检测缺血再灌注损伤(IRI)后不同时间点肾脏细胞的凋亡率。肾细胞悬液的制备按照操作说明书进行。将制备好的肾细胞混悬液染色后上流式细胞仪检测。应用CellQuest软件获取细胞10000个，以ModFit软件进行分析,测定细胞凋亡率(AI)，并绘制DNA含量直方图。7　　1.3统计学分析采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析，数据以x±

6、s表示，均数间比较采用t检验。　　2结果　　2.1术后生存情况移植术后24h内，两组大鼠均全部存活(100%)。　　2.2肝移植术后肝功及肾功的变化术后1h肝移植组即可见CREA、BUN显著升高，术后3、6、12h其水平逐渐升高，至术后12h达最高峰，明显高于对照组(P<0.05)。见表1。　　2.3Fas蛋白表达对照组仅有小部分肾小管上皮细胞核内可见Fas蛋白表达阳性颗粒，于术后12h达最高峰，阳性率约3%。肝移植组Fas蛋白在术后1h时即可见显著表达，此后表达逐渐增强，术后12h时阳性细胞率达高峰，约16%，随后表达开始逐渐下降，两组相比差异显著(P<0.05)。

7、见图1。表1大鼠肝移植术后血清BUN、CREA变与对照组比较：1)P<0.05;下表同　　2.4肾脏细胞AI检测对照组术后1h出现细胞凋亡，于术后12h达最高峰，阳性率约2.94%。肝移植组术后1h时即出现细胞凋亡，于术后12h达最高峰，AI为14.46%;随后凋亡率开始下降，两组相比差异显著(P<0.05)。见表2，图2。表27大鼠肝移植术后肾脏组织的PEI及AI(x±s，%)　　3讨论　　IRI是指组织缺血缺氧达到一定程度和时间后将导致细胞损伤，而当缺血缺氧组织得