最新制备型高效液相色谱PPT课件.ppt

《最新制备型高效液相色谱PPT课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、制备型高效液相色谱在生物制药中的应用基因工程药物:白细胞介素、胰岛素。天然产物:蛋白质,多肽,多糖。第一节高效液相色谱法简介液相色谱的发展史1903年，色谱法问世俄国植物学家茨维特1903年3月21日，大会报告“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”1906年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法1931年，库恩（Kuhn）分离胡萝卜素，1938年，Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，获得了1938年的诺贝尔化学奖。1941年，马丁（Martin）和辛格（Synge）提出液液分配色谱法，

2、1952年度的诺贝尔奖。60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研制(1)高压输液泵(2)在线脱气装置作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。在线脱气、超声脱气、真空脱气等脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。PressureDampersO2,N2,CO2…（3）梯度洗脱装置Isocraticelution恒定组成的单一溶剂体系Gradientelution以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，目的是分离多组容量因子相差较大的组分High-PressureMixing2进样系统六通阀3

3、色谱柱Normalcolumn5-m、4.6-mNarrowborecolumn1-3mMicrocolumn<1m色谱柱是实现分离的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。色谱柱填料sphericalandirregularsilicaparticlesMacroporoussphericalsilicaparticle.[K.K.Unger,Poroussilica,Elsevier,1979]基质：载体或担体。数m~数十m，球形。硅胶或有机高分子聚合物Pellicula

4、rparticlePorousparticle30-50m1-2m3-10m色谱柱填料功能层：物理吸附或化学键合三、高效液相色谱法的特点采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器,从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。和经典液相相比有以下优点：快速、灵敏度高、分辨率高、自动化程度高等。四、制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱法的区别流速不同检测池不同上样量不同色谱柱不同五、色谱的基本理论及有关参数两大理论：塔板理论(theplatemodel):阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板

5、组成；相似于精馏过程，色谱分离也是一个分配平衡过程.N=16(tR/wb)2N=5.54(tR/w1/2)2速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。H=A+Cu有关参数分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度,一般情况下,分离度大于1.5时称分离完全.只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。在色谱分析中要求：两组分的保留值差别要足够大。两色谱峰要足够窄。待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短.容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。选择因子：两组分容量因子的比值容量因子、选择因子、理论塔板数对分离度的影响六、制

6、备型高效液相色谱的重要参数Capacity:纯化过程中，目标物质的上样量。可以是体积也可以是质量。Speed:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。Recovery:产品贵重时此项很重要。流动相的条件、环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品合适的环境条件。Resolution:在纯化的最后阶段，此项很关键，尤其是杂质的结构和目的物结构相似时。七、分离机理和色谱类型分离蛋白质类物质时的分离依据：疏水性分子大小等电点结构特异性色谱介质按分离机理分为正相色谱反相色谱：常加入TFA离子交换色谱：阴离子交换色谱（DEAE二乙基氨基乙基，Q季胺盐）阳

7、离子交换色谱（CM羧甲基S磺酸基）凝胶过滤色谱疏水色谱：苯基，辛基等。金属螯合色谱：镍、铜等亲合色谱第二节分离方案的设计Whatistheintendeduseoftheproduct?Whatkindofstartingmaterialisavailableandhowshoulditbehandled?Whatarethepurityissuesinrelationtothesourcematerialandintendeduseofthefinalproduct?Whathastoberemoved?Whatmustberemove

8、dcompletely?Whatwillbethefinalscaleofpuridication?Whataretheeconomicalconstraintsandwhatresource