制备型高效液相.ppt

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1、制备型高效液相制备型高效液相色谱是一种快速,有效的分析分离工具。本文介绍了制备型高效液相色谱基础理论及基本装置,介绍了样品的预处理和应用实例,分析了目前制备型高效液相色谱技术存在的问题并对该技术未来的发展进行了展望。高效液相色谱分析法Highperformanceliquidchromatography一、液相色谱仪器流程图近年来,从自然资源中寻找具有生物活性化合物的探索工作日益受到人们的关注。人们在运用高效的筛选方法,从植物、海洋生物及微生物中发现新的先导化合物的同时需要一个快速、有效的分离方法以

2、分离目标化合物,而色谱技术是迄今人类掌握的对复杂混合物分离效率最高的一种方法,能够分离物化性能差别很小的化合物[1]。分析型HPLC技术一经出现就引起广大研究者,特别是分析化学工作者的高度重视,使这项技术在分析应用方面取得了巨大成功。现在随着人们大规模分离的需要,制备型高效液相色谱技术也相应产生了,并受到了人们越来越广泛的重视。在我国,该技术已被列入?863工程生物技术领域的攻关项目中[2]。由于技术上的原因,长期以来制备型液相色谱技术发展缓慢,但是随着理论研究的深入,新颖的填料、新的填充

3、方法以及在仪器和流程上的进展,近年来该技术获得了很大的发展。1基础理论人们对色谱基础理论进行不懈的研究,提出了众多的理论。其中比较著名的有:1.平衡色谱理论。在1940年由Wilson[3]提出,该理论认为在整个色谱过程中,组分在流动相和固定相之间的分配平衡能瞬间达成;2.塔板理论。在1941年由Martin和Synge[4]提出,该理论将色谱过程比拟为蒸馏过程,把色谱柱看成是由一系列平衡单元!理论塔板所组成。在每一个塔板高度内,组分在流动相和固定相之间的分配平衡能瞬间达成;3.纵向扩散理论。由Amund

4、son[5]等人通过大量实验提出,该理论认为在色谱过程中,组分在流动相的轴向扩散是影响色谱区域谱带扩张的主要因素,而有限的传质速率对区域谱带扩张没有影响;4.速率理论。该理论认为组分在流动相和固定相之间有限的传质速率是影响色谱区域谱带扩张的主要因素,而轴向扩散的影响可以忽略;5.双膜理论。Funk等人把流动相和固定相看成是两块相互紧密接触的平面薄膜,整个传质阻力为流动相膜的传质阻力和固定相膜的传质阻力所构成,组分在界面接触处达到分配平衡。简单大男制备分离的色谱模型和分析分离的模型相似,但在具体操作中两者的指

5、导思想却有着本质的不同。在制备分离中,人们总是希望在尽可能短的时间里得到尽可能多的纯组分。欲得到负载必须以分离效果为代价,即在保持最低分辨率的前提下,使柱子超载以得到最大的物料通过量。而分析分离中在最短时间里得到最大的分离效率则是人们希望得到的[6]。制备分离选择的是高柱效、高柱容量的色谱柱,而且使色谱柱在超载状态下工作。所谓超载,通常将理论塔板数下降10%时柱容量[7]。较为理想的制备条件的选择包括上柱量,容量因子,选择性以及柱效[8]。2基本装置制备型HPLC是一种基于组分在固定相(柱填料)和流动相

6、(淋洗液)中分配系数的微小差异,当二相作相对运动时,样品中的各组分将形成不同的迁移速度的谱带而实现分离的新型高效分离技术。对于制备型HPLC而言,装置不像对分析型HPLC那样关键,使用不很高级,价格较低的装置往往可以获得令人满意的分离效果。制备型HPLC装置主要由输液泵、进样系统、色谱柱、检测器、馏分收集器、数据采集与处理系统等部分组成。2.1输液泵在制备型HPLC不需要具有很高的输送压力,一般为19.6MPa。输液泵采用的是恒流的机械往复泵或恒压的气动放大泵较理想,因为它们具有较高的输送速率和连

7、续输出溶剂的能力。然而当采用装入小颗粒固定相的粗柱进行制备型HPLC时,例外地需用能提供较大压力的泵。在某些场合,所需压力高达150bar,此时采用薄膜泵较合适。对于内径较小的制备柱可使用分析型的输液泵,内径较大的制备柱,输液泵所需的输送能力可从分析型柱子所做的实验条件参数计算出来。2.2进样系统在制备型HPLC分离中,可以采用一个进样阀(如六通进样阀)将较大量的样品方便的注入柱子而不影响流动相流动。通过更换样品环可以方便的改变进样量,最大可达10mL。如果使用注射器,一般采用停留进样技术,即样品在常压下注

8、入,然后再从新起动泵。若样品量非常大,可以采用停留技术,借助于一台小体积泵将样品定量地注入柱中。也可采用隔膜进样法,用注射器将样品定量地注入柱中。2.3色谱柱相对于分析型色谱,制备色谱的核心就是色谱柱。为提供既稳定又高效的色谱柱,并用小尺寸颗粒进行填充,最常用也是最易实现的效果较为理想的是动态轴向压缩柱(DACTM)技术[9]。DAC技术为使用者提供了用任一种填料自己装填色谱柱、方便快速地调整柱长度的可