最新RNA干扰完整解析PPT课件.ppt

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1、RNA干扰完整解析RNA的干扰RNA干扰是什么RNA干扰的发现RNA干扰的作用机制RNA干扰的应用RNA干扰RNA干扰存在的问题什么是RNA干扰？英文：RNAinterference，缩写RNAi。概念：是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象RNAi的作用机制RNAi的机制和过程大致分为以下几个阶段进行：(1)siRNA的形成阶段；(2)RNA诱导的沉默复合物(RNA-

2、inducedsilencingcomplex，RISC)形成阶段；(3)效应阶段；(4)扩增阶段。RNAi机制外源病毒转座子目标识别内切酶切割目标外切酶降解RNARdRP合成RNA激活的siRNA复合物双链siRNA异常ssRNARdRP合成RNA二级siRNA目前，RNAi的作用机制主要是在线虫、果蝇和拟南芥等生物体内阐明的。生物体由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列(invertedrepeats)转录及外源基因导入等原因，细胞中可出现dsRNA分子。当各种原因产生的dsRNA在细

3、胞中出现时，细胞中一组特定蛋白复合物可识别dsRNA，此阶段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dicer结合，然后Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21~25nt大小的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。(1)siRNA的形成阶段核酸内切酶核酸外切酶解旋酶Dicer同源搜索活性siRNAslongdsRNADicercontainstwoRNAseIIIdomainsDicer

4、定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后，向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21~25nt大小在3’端带有2~3个碱基悬端和5’端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。19ntduplex2nt3’overhangssiRNAshaveadefinedstructuresiRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKR)的激活而使其被降解，从而大

5、大减少了其对mRNA的抑制作用。在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于RNaseⅢ核糖核酸酶家族中的第三个家族，该家族的RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及PAZ模体(motif)，其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA，因此，Dicer酶被认为是启动RNAi效应的关键。然而，令人费解的是，为什么Dicer酶的降解产物是21nt~23nt的siRNA呢?最近对RNaseⅢ催化结构域的结构的研究使其真相大白。Dicer一种核酸酶,负责将dsRNA转化为siRNA：它属于RNaseⅢ家

6、族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现,其催化结构域在dsRNA上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer结构略有不同,致使siRNA长度存在微小差别。DicerModelsforDicercleavage启始阶段加工酶加工成21-23核苷酸片段DicerRISCmRNA被核酸外切

7、酶或核酸内切酶降解①②siRNA的形成siRNADicerRISC(2)RNA诱导的沉默复合物形成阶段生成的siRNA和RNAi特异性酶，如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC（RNA-inducedsilencingcomplex），具有序列特异性核酸内、外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)(3)效应阶段siRNA引导RISC与同源性的mR

8、NA结合，在ATP及解旋酶(如Rde-3、MUT-6、MUT-14)的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250X103大小的前体形式变成约100X103左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链互换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5’起始端下游7~10个核苷酸处切断mRNA，起到特异地抑制基因表达的效果。效应阶段mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解解旋酶核酸外切酶同源性检索活性核酸内切酶RISC在这些机