RNA干扰完整解析课件.ppt

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1、RNA的干扰RNA的干扰RNA干扰是什么RNA干扰的发现RNA干扰的作用机制RNA干扰的应用RNA干扰RNA干扰存在的问题什么是RNA干扰？英文：RNAinterference，缩写RNAi。概念：是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象RNA干扰的发现2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（CraigC.Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。19951

2、99219911990Napoli等尝试在有颜色的矮牵牛(Petuniahybrida)花翼瓣中通过介入CHS基因使查尔酮合成酶过量表达,来加深花瓣的颜色。出人意料的是,花瓣颜色不仅未加深,而且42%的介入CHS基因的植物的花全部变白或有白色或灰白图案。Fire等把RNA注入新秀杆线虫以控制基因的表达Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达2002200019991998美国华盛顿卡耐基研究院

3、的Fire等在研究RNA干扰所需的结构和传递条件的试验中发现,把dsRNA正义链和反义链的混合物注入线虫体内,比注入单独的任意一个正义链或反义链的效果均要好。Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA中间产物。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）引发RNAi。Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small

4、hairpinRNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA可在避免激活dsRNA依赖的蛋白激酶和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶信号转导途径的同时，有效抑制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。RNAi的作用机制RNAi的机制和过程大致分为

5、以下几个阶段进行：(1)siRNA的形成阶段；(2)RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)形成阶段；(3)效应阶段；(4)扩增阶段。RNAi机制外源病毒转座子目标识别内切酶切割目标外切酶降解RNARdRP合成RNA激活的siRNA复合物双链siRNA异常ssRNARdRP合成RNA二级siRNA目前，RNAi的作用机制主要是在线虫、果蝇和拟南芥等生物体内阐明的。生物体由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列(invertedrepeats)转录及外源

6、基因导入等原因，细胞中可出现dsRNA分子。当各种原因产生的dsRNA在细胞中出现时，细胞中一组特定蛋白复合物可识别dsRNA，此阶段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dicer结合，然后Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21~25nt大小的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。(1)siRNA的形成阶段核酸内切酶核酸外切酶解旋酶Dicer同源搜索活性siRNAslongdsRNADice

7、rcontainstwoRNAseIIIdomainsDicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后，向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21~25nt大小在3’端带有2~3个碱基悬端和5’端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。19ntduplex2nt3’overhangssiRNAshaveadefinedstructuresiRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰

8、素样反应和蛋白激酶(PKR)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对mRNA的抑制作用。在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于RNaseⅢ核糖核酸酶家族中的第三个家族，该家族的RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及PAZ模体(motif)，其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA，因此，Dicer酶被认为是启动RNAi效应的关键。然而，令人费解的是，为什么