欧洲药典EP6.0细菌内毒素-(中文).doc

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1、2.6.14细菌内毒素本法利用鲎试剂（从鲎——Limuluspolyhemus或Tachypleustridentatus——血细胞提取物（amoebocytelysate）制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。该检查包括三种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；第二种为浊度法（基于内源性底物断裂后，产生的浊度变化）；最后一种为显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。这一章阐述了下面6种方法：方法A：凝胶法：限度试验方法B：凝胶法：半定量试验方法C：动态浊度试验方法D：动态显色法方法E：终点显

2、色法方法F：终点浊度法检测时，可用6种方法的任一种进行试验。当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以专论中的方法A的测定结果为准。试验操作过程应防止内毒素的污染。仪器所有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。注：这一章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。内毒素储备标准溶液的制备用内毒素标准品制备内毒素储备标准溶液；所用的内毒素标准品必须先用国际标准品校准，如

3、内毒素标准BRP。内毒素以国际单位（IU）表示。IU的换算见国际卫生组织公布的国际标准。注：一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用细菌内毒素试验检查用水（BET检查用水）稀释，制成适当的系列稀释液，即得BET检查用内毒素标准溶液。得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释活性成分或药品来制备供试品溶液。某些成分或药品可能在其它的水溶液中溶解度更高。如有必要，

4、调节待测溶液（或它的稀释液）的pH值，使鲎试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选鲎试剂生产商的指定pH范围内。一般要求供试品溶液的pH值范围为6.0——8.0。可用鲎试剂生产商推荐的酸、碱或适当的缓冲溶液来调解pH值。酸或碱溶液须用BET检查用水在去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。确定最大有效稀释倍数最大有效稀释倍数（MVD）指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。MVD按下列公式确定：MVD=内毒素限值×供试品溶液浓度/λ内毒素限值：在剂量的基础上，注射药物的活性成分的内毒素限度为K/MK=人每公斤体重每小时最大可接受的内

5、毒素剂量（EU/kg）M＝人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。专论中，注射剂的活性成分的内毒素限度的单位有IU/ml、IU/mg、IU/生物活性单位等。供试品溶液的浓度表示法：－当内毒素限度以质量（IU/mg）表示时，用mg/ml表示浓度。-当内毒素限度以（IU/ml）表示时，用ml/ml表示浓度。-当内毒素限度以生物单位（IU/Unit）表示时，用Units/ml表示浓度。λ=指凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度，或指浊度法或显色法使用的标准回归曲线上最低点（IU/ml)的对应值。凝胶法（方法A和B）凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或定量内毒素的方

6、法。在标准条件下，可引起鲎试液凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度。为确保试验结果精确、有效，应根据预备试验中的说明开展试验，复核鲎试剂的标示灵敏度和试验的干扰因素。（1）预备试验（i）鲎试剂的标示灵敏度复核试验灵敏度用IU/ml表示。应在鲎试剂用于检查内毒素之前对灵敏度进行复核；复核试验需要制备标示灵敏度λ的4支平行管。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。用BET检查用水稀释内毒素储备标准溶液，制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四种浓度的标准溶液。在每支试管中，分别混合等体积（通常为0.1mL)

7、的鲎试液(lysatesolution)和标准溶液。如使用的是装有鲎试剂冻干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接加入溶液。按照鲎试剂生产商的建议，将反应混合物孵育一段时间(通常在37±1℃下保温60±2分钟)，在此过程中，不能振动试管。凝胶的完整性测试：如使用试管作为容器，先将试管从保温箱中取出，再缓缓将试管倒转1800。如果形成了坚实的凝胶，倒转后凝胶不移位，此时将该项检查的结果记录为阳性。如未能形成坚实且不变形的凝胶，该项检查的结果即为阴性。仅在最低浓度的标准溶液的所有平行管的检查结果均为阴性的情况下，试验方为有效。反应终点浓度指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈

8、阳性结果的浓度。将终点浓