美国药典24版细菌内毒素检查法.doc

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1、美国药典24版细菌内毒素检杳法2007-12-0314:22木文是USP24细菌内毒索检査法(BACTERLALENDOTOXINSTEST)的译文，但目前执行的标准是CSP24版第二増补本(USP—NF19SecondSupplement)的细菌内毒素检査法，读者可对照学习，从屮可看出USP24细菌内毒素检查的不足Z处。本文将介绍用賞试剂检测样品内或样品上存在的细菌内薄索浓度的方法。賞试剂(LimulusAmebocyte,LAL)来自晝的循环细胞,经水提取而行，制备和检验后，用于凝固法。反应的终点是将供检样品稀释后，与平行稀释的参考

2、内毒索标准进行直接比较得到的。测得的内毒索含量用规定的内毒索单位表示。卷试剂也是用浊度法或显色法來读取数据的，这些试齐只要能满足这些选择方法的要求，就可以使用。在做试验时，船耍先做出一条标准曲线，并用该曲线计算供检样品的内毒素含量，包括样品和对照液加賞试剂后的培育时间和在分光光度计上读取光密度时使川的波长等操作，都应该事先规定好。如果是终点浊度法，则到达培育期后，应立刻读取读数。而动力学检测(凶手浊度法和显色法)，光密度的测定是贯穿于整个反应期间，而用于计算结果的百分数就是从这些读数中计算出來的。在用终点法的显色法检测时，在到达事先规定

3、的反应时间后，添加停止酶反应的试剂使反应停止后，再读取数据。1、参考内毒素标准与对照内毒素标准参考内毒素标准(Referencestandardendotoxin,RSE)是美国药典(USP)的内毒素参考标准,其效价为每瓶10000个USP内毒素单位(EU)。每瓶参考内毒素标准加5m1壷试剂用水(LALReagentWatet),用旋转搅拌器间歇搅拌30min使其溶解，制成原液，用这一原液制作介适的系列稀释。原液应保存于冰箱中，用于以后的稀释，但保存时间不得超过14d。用前，用旋转搅拌器强力搅拌至少3min,每一步稀释，至少搅拌30s,

4、然后才能用它稀释下一步。经稀释的参考内毒索不得贮存待以后使用，因为吸附作用会使其失去活性。对照内毒索标准(Contuolstandardendotoxin,CSE)是以参考内壽素标准为标准另行制备的。一批新的对照内毒索标准在使用前应进行检定。检定时使用的卷试剂应为试验中使用的同批蛍试剂。参考内進索标准对照内琏索标准进行检定时，可使用凳试剂的凝固法，按“试验操作”进行。每批对照内毒素标准，至少取1瓶与1瓶参考内毒素标准进行对比。参考内毒素标准的每个稀释度作4管。每瓶或每个样品的对照内毒素标准的每个稀释度也都要4管。参考内诗素标准终点的对数

5、Log10的平均值和对照内毒素标准终点的对数LoglO平均值之间的差值的反对数等于对照内毒索标准效价的标定值。可根据情况，将其变换成每ng干燥制剂的单位数或每瓶所含的单位数。适宜的对照内逛素标准的效价应不小于2EU/ng也不大于50EU/ngo2、试验的准备愛试剂的灵敏度应经过确证。试验中使用的所有容器和用具，都必须在2250-C的烤箱中，用足够的时间进行加热处理、破坏这些用具表面上可能存在的外源性内毒素。内毒素试验的结果是否可靠，还必须从试验使用的各种用具、溶液、洗涤用品中取样或提取样品，并用适当的方法证明它们对反应没冇抑制或拉强或其

6、它干扰作用。可按卜-述方法进行抑制试验或増强试验。试验中应设置阴性对照。如果卷试剂的原材料、生产方法或处方发生改变时都要重新进行试验。3、寅试剂灵敏度的确认试验为了确认賞试剂标签上的灵敏度，毎批至少取1瓶样品进行检定。参考内毒索标准(或对照内毒索标准)作2倍系列稀释,稀释成2.0入，1.0入，0.5入和0.25X。其中X是蛍试剂标签上的灵敏度EU/ml。上述4个稀释度和阴性对照都要重复做4管。所得结果的几何平均值的对数应大于或等于0.5X,小于或等于2.0入。每一批新的卷试剂，使用前都必须作标签灵敬度的确认试验。4、抑制试验和增强试验川

7、不超过地大有效稀释而检测不出内毒索的样品，不加或内毒索，使最后浓度等T-2.0X,1.0X,0.5X和0.25入。按照试验操作(TestProcedure)项的规定用标准内毒索进行检定。不加和加内毒索的样品管至少做4管。同时，用水稀释上述相同浓度的内毒索和阴性对照各两管，做平行两管试验。按照计算和判定项的方法，计算样品终点内毒素浓度的儿何平均值。如果所得结果大于或等于0.5X,小于或等于2.0X,则该样品适合作细菌内毒素检查。用中和、灭活或除去干扰物质方法或用不超过故大有效稀释度稀释检品后，可重做抑制试验和増强试验。如果用不超过最人冇效

8、稀释法，对已知加量的内琏索可以克服抑制和増强作用。则样品可以经过稀释后，再作内毒素检查。如果在试验条件下，对未处理的样品检查出有内源性内毒素。则该样品不适合用于作抑制或拉強试验。不过，这种样品可用超过滤法将