细菌内毒素检查法

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1、细菌内毒素检查法细菌内毒素检査法(2005年一部)附录XIIID细菌内毒素检査法本法系利用當试剂來检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒索的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒索检査包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果冇争议时，除另冇规定外，以凝胶法结果为准。内毒素的量用内毒素单位(EU)衣示。细菌内毒索国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。用丁•标定、复核、仲裁卷:试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素

2、工作标准品系以细菌内毒索国家标准品为基准标定其效价，用于试验中卷试剂灵放度复核、干扰试验及各种阳性对照。凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含呈小丁-0.015EU/ml的火菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/mL试验所用器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内髯索，常川的方法是250C干烤至少60分钟,也可采用其他确证不干扰细菌内毒素的适宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。供试品溶液的制备

3、某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液小浸提制成供试品溶液。-般要求供试品溶液的PH值在6.0-&0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液(或其稀释液)的PHffi,可使用酸、碱溶液或餐试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因fo内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)-般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值,以EU/mkEU/mg或EU/U(活性单位)表示;K为人每公斤体

4、重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg.h)表示，注射剂K=5EU/(kg.h),放射性药品注射剂K=2・5EU/(kg.h),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg.h)；M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或U/(kg.h)农示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必耍调整，但需说明理由。确定最大有效稀释倍数(MVD)最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数,在不超过

5、此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式來确定MVD：MVD=CL/A式中L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度,当L以EU/ml表示时，贝ijC等于1.0ml/ml,当L以EU/mg或EU/U表示时，C的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度C=A/L：入为在凝胶法中卷试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法屮所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。方法1凝胶法凝胶法系通过蜜试剂与内毒索产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

6、磁试剂灵做度复核试验在木检查法规定的条件下，使傲试剂产生凝集的内毒索的最低浓度即为娥试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的蜜试剂或试验条件发生了任何町能影响检验结果的改变时，应进行卷试剂灵敏度复核试验。根据蛍试剂灵敏度的标示值（入），将细菌内毒素国家标准晶或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检杳用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制成2.0入、入、0.5入和0.25入四个浓度的内毒索标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml餐试剂溶液的10mm*75mm试管或复溶后的0.1ml/支规

7、格的卷试剂原安漩18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管屮溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入37°C±1°C的恒温器中,保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°,若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者•为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结杲。当最人浓度2入管均为阳性，最低浓度0.25入管均为阴性，阴性对照管为阴性，试

8、验方为有效。按下式计算反应终点浓度的儿何平均值，即为卷试剂灵敏度的测定值（入C）。IXAc=lg<-1>4式小X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中戢后一个呈阳性结果的浓度。当入c在0.5入〜2.0入（包拆0.5A和2.0入）时，方可用丁细菌