附录ⅹⅲd细菌内毒素检查法

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1、附录XIIID细菌内毒索检查法.木法系利用蛍试剂来检测或最化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品屮细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。细菌内毒素国家标准品系占人肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁蛍试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定英效

2、价，用于试验中的卷试剂灵敏度复核、T扰试验及各种阳性对照。细菌内毒索检查卅水系指内毒索含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)或().()()5EU/ml(用于光度测定法)且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒索。常用干热灭菌法(250°C、30分钟以上)去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选川标明无内毒素并H对试验无于扰的器械。试验操作过程应防止微牛物的污染。供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释

3、或在水性溶液中浸提制成供试晶溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0〜&0的范围内。对于过酸、过碱或木身冇缓冲能力的供试品，盂调节被测溶液(或其稀释液)的pH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在己去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内離素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示；K为人每公斤体重每小时最人可接受的内毒素剂量。以EU/(kg•

4、h)表示，2014年度细分行业报告汇集制造行业报告互联网行业报告农林牧渔行业报告注射剂K=5EU/(kg•h),放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg•h),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg•h)oM为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,以ml/(kg•h)>mg/(kg•h)或U/(kg•h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。若供试品按体表面积给药，M=(最大给药剂量/m2/hX1.62m2)/60kgo按人用剂虽:计算限值时•，如遇特殊情况，町根据生产和临床川约实际情况做必要调整，但需说

5、明理由。确定最大有效稀释倍数(MVD)最人有效稀释倍数是指在试验屮供试品溶液被允许稀释的最人倍数，在不超过此稀禅倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：MVD=cL/X式中L为供试品的细菌内毒索限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml,当L以EU/mg或EU/U表示吋，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD収1,可计算供试品的最小有效稀释浓度c=X/L；入为在凝胶法屮蛍试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法屮所使用的标准曲线上

6、最低的内毒素浓度。方法1凝胶法凝胶法系通过蜜试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。卷:试剂灵敏度复核试验在本检杳法规定的条件下，使蛍试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为蛍试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的起试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结杲的改变时，应进行卷试剂灵敏度复核试验。根据错试剂灵做度的标示值(入)，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检杏用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2入、X、0.5X和0.25入四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡

7、混合器上混匀30秒钟。収分装有0.1ml卷试剂溶液的10mmX75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的卷试剂原安瓶18支，具屮16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒索标准溶液，每一个内毒索浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒索检查用水作为阴性对照。将试管屮溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37°C±1°C的恒温器屮，保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻収出，缓缓倒转180°,若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；耒形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受

8、到振动造成假阴性结果。当最人浓度2X管均为阳性，最低浓度0.25X管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的儿何平均值,即为蛍试剂灵敏度的测定值（Xc）oXc=lg-1（EX/4）式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素