各国药典细菌内毒素检查法

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1、JP本法利用鲎试剂（从鲎——Limuluspolyhemus或Tachypleustridentatus——血细胞提取物制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。检测时，可用其中任一种方法进行试验。当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以凝胶法测定结果为准。试验操作过程应

2、防止内毒素的污染。仪器所有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。内毒素储备标准溶液的制备以BET检查用水溶解内毒素10000对照标准品或内毒素100对照标准品，制取细菌内毒素试验（BET）的内毒素储备标准溶液。内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。1EU相当于1个内毒素国际单位（1U）。内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用水稀释，即得BET检查用内毒素标准溶液。得到的稀释液应

3、尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释药品来制备供试品溶液。药用容器内盛放的供试品溶液的制备方法见其他具体规程。如有必要，调节待测溶液的pH值，使鲎试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选鲎试剂的使用pH范围内。一般要求供试品溶液的pH值范围为6.0——8.0。试液或调节pH值用溶液应用BET检查用水配制，在去除内毒素的容器中贮存。确定最大有效稀释倍数最大有效稀释倍数（MVD）指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。MVD按下列公式确定：MVD=内毒素限值×供试品溶液浓度/λ内毒素限值：根据剂量，注射剂的内毒素限度

4、即为K/M的值，其中K为人每公斤体重可接受的内毒素中热原的最小量（EU/kg），M指人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。供试品溶液的浓度表示法：当内毒素限度以质量（EU/mg）表示时，用mg/mL表示浓度。当内毒素限度以（EU/mEq）表示时，用mEq/mL表示浓度。当内毒素限度以生物单位（EU/Unit）表示时，用Units/mL表示浓度。当内毒素限度以体积（EU/mL）表示时，用mL/mL表示浓度。λ：指凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/mL)，或为浊度法或显色法使用的标准回归曲线上最低点（EU/mL)的对应值。凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测

5、或定量内毒素的方法。为确保试验结果精确、有效，应根据预备试验中的说明开展试验，复核鲎试剂的标示灵敏度和试验的干扰因素。（1）预备试验（i）鲎试剂的标示灵敏度复核试验在规定的条件下，使所用鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为该鲎试剂的标示灵敏度。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。按照下述步骤开展试验。用BET检查用水稀释内毒素储备标准溶液，制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四种浓度的标准溶液。用BET检查用水或适当的缓冲液溶解鲎试剂，得到鲎试液。在每支试管中，分别混合等体积（通常为0.1mL)的鲎试液和标准溶液。如使

6、用的是装有鲎试剂冻干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接加入溶液。装有反应试剂混合物的试管（或西林瓶或安瓿之类的容器）通常在37±1℃下保存60±2分钟，在此过程中，要避免试管的振荡。保温结束后，为测试凝胶的完整性，缓缓将每个容器倒转1800。如果形成了坚实的凝胶，倒转后凝胶不移位，此时将该项检查的结果记录为阳性。如未能形成凝胶，或形成的凝胶不坚实、在倒转过程中出现了滑脱，该项检查的结果即为阴性。试验时，每一个浓度的标准溶液平行做4管。仅在每组试验中的0.25λ标准溶液的检查结果为阴性的情况下，试验方为有效。如试验无效，确认试验条件后，重复该试验。反应终点浓度指系列递减的内毒素

7、浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。使用下面的公式，计算终点浓度的几何平均值：终点浓度的几何平均值＝lg-1(Σe/f)Σe＝所用系列溶液的终点浓度的对数值的和f＝平行管的数量当终点浓度的几何平均值在0.5λ至2.0λ之间，可判定受试鲎试剂的标示灵敏度为λ。（i）干扰因素试验开展该项实验的目的是检查供试品溶液中反应的增强因素或阻抑因素的存在。按表1制备溶液A、B、C、D。其中A、B为供试品溶液，C、D以BET检查用水制取。A、B、C、D构成一组试验，再依样配制一组溶液以供平行试验用。孵育温度、孵育时间和形成凝胶的确认方