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1、高效液相色谱分离的基本原理色谱分离效果图2高效液相色谱仪的分析原理高效液相色谱仪的结构色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱3聚合物基质材料交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。pH稳定性好：pH1－13。可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。在中等pH条件下对强碱性物质具有更好的峰形。填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。分离效率相对硅胶而言比较低重现性不好7硅胶外形的影响无定型硅胶:最初的HPLC填料粒径>5µm柱床稳定性差
2、比表面积较小价格便宜球形硅胶:现代HPLC填料粒径小(5µm,3µm,<2µm)重现性好稳定性好分离效率高8硅胶纯度的影响硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。以前的纯度较低的硅胶（称为A型硅胶）,A型硅胶是以金属硅酸盐制备而来，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非离子化合物的分离。纯度高、酸性较弱的硅胶(称为B型硅胶)，这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾峰。9硅胶纯度的影响M+表面金属能与螯合化合物络
3、合MSiOH内部的金属对表面硅羟基具有活化作用强酸性A型硅胶C18B型硅胶C1810硅胶孔径的影响孔径作用和效能<60nm对HPLC分析没有用，会引起峰形拖尾和较低的分离效率60–150nm对小分子的分离效果理想(MW<4,000to130,000),例如药物分子、传统的中药和小分子的缩氨酸300–1,000nm对大分子的分离效果理想，如多肽、核苷和高分子>1,000nm对聚合物的分离效果理想，如DNA和生物大分子11硅胶粒径的影响粒径作用和效能5µm目前应用最广泛，可以满足从分析到半制备的分离3–3.5µm常用于分析柱上的快速分离，色
4、谱柱短，节省溶剂<2µm常应用于超快速分离，highthroughput,分离度高7–10µm常用于半制备色谱柱10–20µm常用于制备色谱柱12HPLC色谱柱的构成类型内径D(cm)柱长(cm)粒径(µm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制备柱0.8–1.010-255-20制备柱2.0–5.010-255-2013键合相键合相:反相:70%;C18,65%;C8,15%;Cyano,5%,苯基柱<5%,正相:20%;硅胶、-NH2、-CN其它(手性柱,离子交换柱):10%反相色谱是目前应
5、用得最为广泛的高效液相色谱方法。C18和C8在反相色谱终应用得最为广泛。14为什么反相色谱应用如此广泛?它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。15封尾封尾是用如三甲基硅烷等小分子与键合了C18以后的硅胶进行进一步的反应。由于硅烷相对很大的体积，使得C18和其它键合相在发生键合反应时只能覆盖
6、不到硅胶表面的50%。硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。16评价色谱柱好坏的标准1）理论塔板数N2）拖尾因子Tf3）色谱柱背压4)色谱柱批与批之间的重现性5）pH值的适用范围6）使用寿命17理论塔板数N粒径(µm)柱长(cm)塔板数N10156,000-7,00010258,000-10,0005107,000-9,00051510,000-12,
7、00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00031012,000-14,00031517,000-20,00018拖尾因子TfAs=1.0-1.05很好As=1.2一般As=2差As=4很差不对称因子和拖尾因子的关系As(at10%)Tf(at5%)1.01.01.31.21.61.41.91.62.21.82.52.0不对称因子(As)=BAA拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高19色谱柱背压粒径均一会使色谱柱的背压相对较低。色谱柱两端的压力降不应超过公式计算所得的30％。硅
8、胶粒径对色谱柱的压力具有很大的影响；硅胶粒子越小，色谱柱的背压越大。色谱柱的背压还与流动相的粘度有关。P=3000Lηt0dp2P是色谱柱背压(psi)，L是色谱柱的长度(cm),η流动相的粘度(cP)，t
