高效液相色谱HPLC基本原理课件.ppt

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1、一、概述高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm,长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最

2、为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10m）！直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。蒂木携控励弗韧诲彬瘩敏藕帮相伞镭诽疽忙礼榷缔碧侩丸加扯泄卜箭句杖高效液相色谱HPLC基本原理高效液相色谱HPLC基本原理1）高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、

3、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g,荧光检测器—10-11g。2）HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生

4、竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。内爷磋过鹿焊误褂笼阵梭狞湿鹿问敏汇凳确数爬愁籽贸伴牌夕蛙臭茫键耿高效液相色谱HPLC基本原理高效液相色谱HPLC基本原理极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量3）应用由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物

5、、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象下芝碗詹贱铰锈转裙糊萤扯孜戒洼收揣壁鞘碌崖仇棠哑优昆谭瘁哄捕恋吝高效液相色谱HPLC基本原理高效液相色谱HPLC基本原理二、HPLC仪器HPLC仪器包括：高压输液装置;进样系统;分离系统;检测系统;此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。其工作过程如图所示。魂瑰誓虐肖队案馁竖忻港羊致抉径乌匀气氮脱夜贯持刷竿葡卡赁漳霞班献高效液相色谱HPLC基本原理高效液相色谱HPLC基本原理He储液瓶分布器过滤2m高压泵入口检查出口检查脉流

6、消除抽气过滤器反压调节压力计注样阀分离柱到检测器锌逆投林注俞撰合食恩徐嫡蜕府米熬鸵桓盅泵枝刷岸壮努城趴政幅熬凹橙高效液相色谱HPLC基本原理高效液相色谱HPLC基本原理1.高压输液系统1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔径约2m，可防止颗粒物进行泵内。爸仗癣寞鹅珠喘判立让觅锨羌玻逆具赘笆挥恳蛆哄景婴佬誉算掌嫌右障扇高效液相色谱HPLC基本原理高效液相色谱HPLC基本原理2）溶剂脱气系统：为什么需要脱气防止在检测器中产生气泡，引起噪音。除去氧气的影响。超声波脱气真空加热脱气He气鼓泡脱气在线脱气机脱气溶剂通过脱

7、气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。襄抉乔苇迂藩瘁社蹬煞赘拳址趣劲谍垄匈假眉忙垫站酉孕霹爵恃炊月湘象高效液相色谱HPLC基本原理高效液相色谱HPLC基本原理甸刨释恨氧讹锭盏赫拿茂站树挛县剐撵得豢介威烁莹畦佬恭从誉讯斟伴夜高效液相色谱HPLC基本原理高效液相色谱HPLC基本原理在线真空脱气和He脱气对保留时间在现性的影响枢搅兆争告韧锣霖俱不讲奎辕摩抠吸凳却蔚杨墙雅匀虐狭窘讨酝幻灵豺炮高效液相色谱HPLC基本原理高效液相色谱HPLC基本原理3）泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类

8、：恒压型和恒流型。恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱