最新酶学第五章 酶的分离纯化与制剂ppt课件.ppt

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1、酶学第五章酶的分离纯化与制剂第一节酶分离纯化的一般原则预防蛋白质变性失效的方法与措施主要内容：防止酶变性失效选择有效的纯化方法酶活性测定贯穿纯化过程的始终主讲教师：赵丹丹2第五章酶的分离纯化与制剂一、酶分离纯化的概述酶工业生产中属于下游技术！最终目的（）整个工作包括三个基本环节：(1)抽提（extraction）：是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；(2)纯化（purification）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；(3)制剂（preparatio

2、n）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。获得高度纯净的酶制剂主讲教师：赵丹丹3第五章酶的分离纯化与制剂四、酶活性测定贯穿纯化过程的始终酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较，这样，我们就能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么条件，它们分别使酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而决定其取舍。主讲教师：赵丹丹7第五章酶的分离纯化与制剂第二节酶的抽提抽提的要求是要将尽可能多的酶、尽量

3、少的杂质从原料引入溶液。主要内容：预处理和破细胞抽提浓缩主讲教师：赵丹丹8第五章酶的分离纯化与制剂一、预处理和破细胞着手酶的提取前，通常应先对酶的原料进行适当的预处理(Pretreatmention)。例如：(1)动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等；(2)油质种子最好先用乙醚等脱脂；(3)种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染；(4)对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。2.在这些预处理后，尽可能以非常新鲜的状态直接应用;否则，应将完整材料立即冰冻保存。主讲教师：赵丹丹9第五章酶的分离纯化与制剂一、预处

4、理和破细胞3.根据酶的分布可分为细胞内酶和细胞外酶。(1)细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题；(2)细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。‘‘周质酶”（periplasmicenzyme）通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就可释放；“膜结合酶’’（membrane-bindingenzyme）则往往还有一个切断酶与颗粒体或膜的连结问题。主讲教师：赵丹丹10第五章酶的分离纯化与制剂一、预处理和破细胞4.细胞破碎（celldisru

5、ption）(1)机械破碎法机械捣碎法，绞肉机、高速组织捣碎器研磨法匀浆法高速捣碎器操作简便、破碎效果高，但易引起局部温度过高，导致酶失效；加石英砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替石英砂时，要注意有时也可能发生吸附变性。在上述机械处理后，为了有利于下一步抽提，可进一步作成丙酮干粉，或者进行反复冰冻溶解处理。主讲教师：赵丹丹11第五章酶的分离纯化与制剂一、预处理和破细胞4.细胞破碎（celldisruption）(2)‘‘丙酮干粉’’（acetonepowder）处理法适用于微生物材料一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在

6、0℃以下的低温条件下、加入5～10倍预先冷至约-20℃的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛丙酮处理优点：①能有效地破坏细胞壁（膜）；②有利于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤产生干扰；③能使某些膜结合酶易于溶解；④丙酮干粉含水量低，便于保存。缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效。主讲教师：赵丹丹12第五章酶的分离纯化与制剂一、预处理和破细胞4.细胞破碎（celldisruption）(3)物理破碎法温度差破碎法压力差破碎法：高压冲击法；突然降压法；渗透压差法超声波破碎法(4)化学破碎法有机溶剂处理表面活

7、性剂处理(5)酶法破碎法外加酶处理自溶法(Autolysis)所谓自溶，就是将浓的菌体悬液在适宜的温度与pH条件下直接保温，或加甲苯、乙酸乙酯以及其他溶剂一起保温一定时间，让菌体自溶液化。有人认为不是好方法，理由是：第一，自溶液中成分十分复杂；第二，有破坏目的酶的危险。主讲教师：赵丹丹13第五章酶的分离纯化与制剂一、预处理和破细胞4.细胞破碎（celldisruption）(6)注意微生物的种类不同处理方法及难易程度也有差异。霉菌：易处理细菌：少量超声和溶菌酶；大量丙酮干粉法或自溶法；工业生产中，细菌材料可以用细菌磨或

8、挤榨器等处理。酵母：由于其壁厚较难对付，过去多用自溶法，后来采用的办法有：①细胞壁溶解酶处理法；②稀盐溶液振荡法；③冷热破壁法。主讲教师：赵丹丹14第五章酶的分离纯化与制剂二、抽提1.抽提方式(1)“普遍”抽提；(2)选择性抽提，即先后用不同溶剂进行选择性抽提。2.由于大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱的水溶液。但抽