酶学第五章酶的分离纯化与制剂

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1、第五章酶的分离纯化与制剂主要内容：酶分离纯化的一般原则、酶的抽提、酶的纯化原理与方法、酶的纯度与产量、酶的纯度与产量、酶的剂型与保存第一节酶分离纯化的一般原则预防蛋白质变性失效的方法与措施主要内容：防止酶变性失效选择有效的纯化方法酶活性测定贯穿纯化过程的始终一、酶分离纯化的概述酶工业生产中属于下游技术！最终目的（）整个工作包括三个基本环节：(1)抽提（extraction）：是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；(2)纯化（purification）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从包含杂质的溶液中

2、分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；(3)制剂（preparation）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。获得高度纯净的酶制剂主讲教师：赵丹丹3第五章酶的分离纯化与制剂一、酶分离纯化的概述3.酶与一般蛋白质纯化过程相比独有的特点：(1)特定的一种酶在细胞中的含量很少；(2)酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。给纯化带来了麻烦迅速找出纯化过程的关键主讲教师：赵丹丹4第五章酶的分离纯化与制剂二、防止酶变性失效除了少数例外，所有操作都必须在低温条件下进行，特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心；大多数

3、酶在pH＜4或pH＞10的情况下不稳定，应控制整个系统不要过酸、过碱，同时要避免在调整pH时产生局部酸碱过量；酶和其他蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作时要尽量减少泡沫形成；重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在都能使酶分解破坏，所有这些必须高度重视。主讲教师：赵丹丹5第五章酶的分离纯化与制剂三、选择有效的纯化方法酶纯化的最终目的是要将酶以外的一切杂质(包括其他酶)尽可能地除去，因而，容许在不破坏待纯化的“目的酶”的限度内，使用各种“激烈”手段。由于

4、酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性，因此可应用各种亲和分离法；而且，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性往往会发生一些有利的变化。这样又扩大了纯化方法与纯化条件的选择范围。主讲教师：赵丹丹6第五章酶的分离纯化与制剂四、酶活性测定贯穿纯化过程的始终酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较，这样，我们就能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么条件，它们分别使

5、酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而决定其取舍。主讲教师：赵丹丹7第五章酶的分离纯化与制剂第二节酶的抽提抽提的要求是要将尽可能多的酶、尽量少的杂质从原料引入溶液。主要内容：预处理和破细胞抽提浓缩一、预处理和破细胞着手酶的提取前，通常应先对酶的原料进行适当的预处理(Pretreatmention)。例如：(1)动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等；(2)油质种子最好先用乙醚等脱脂；(3)种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染；(4)对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。2.在这些预处理后，

6、尽可能以非常新鲜的状态直接应用;否则，应将完整材料立即冰冻保存。主讲教师：赵丹丹9第五章酶的分离纯化与制剂一、预处理和破细胞3.根据酶的分布可分为细胞内酶和细胞外酶。(1)细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题；(2)细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。‘‘周质酶”（periplasmicenzyme）通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就可释放；“膜结合酶’’（membrane-bindingenzyme）则往往还

7、有一个切断酶与颗粒体或膜的连结问题。主讲教师：赵丹丹10第五章酶的分离纯化与制剂一、预处理和破细胞4.细胞破碎（celldisruption）(1)机械破碎法机械捣碎法，绞肉机、高速组织捣碎器研磨法匀浆法高速捣碎器操作简便、破碎效果高，但易引起局部温度过高，导致酶失效；加石英砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替石英砂时，要注意有时也可能发生吸附变性。在上述机械处理后，为了有利于下一步抽提，可进一步作成丙酮干粉，或者进行反复冰冻溶解处理。主讲教师：赵丹丹11第五章酶的分离纯化与制剂一、预处理和破细胞4.细胞

8、破碎（celldisruption）(2)‘‘丙酮干粉’’（acetonepowder）处理法适用于微生物材料一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件下、加入5～10倍预先冷至约-20℃的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛丙酮处理优点：①能有效地破坏细胞壁（膜）；②有利于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤产生干扰；③能使某些膜结合酶易于溶解；④丙酮干粉含水量低，便于保存。缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效。主