酶的分离纯化与制剂

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1、第三章酶的分离纯化与制剂11酶分离纯化的目的酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。21926年Sumner制备了第一个结晶酶，自此以后，酶的分离纯化工作进展很快。到现在已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净。并且根据酶的作用特点、物理化学性质等发展了各种类型的分离纯比方法、试剂和设备，但是，由于酶和它的来源不同，也由于与之共存的高分子物质的复杂多样，因此要使一种酶达到高度纯净，往往需要多种方法协同发挥作用才有可能。23酶分离的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎

2、碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性4物质名浓度(C)价格(P，＄)尿激酶510－53108荧光素酶810－32106胰岛素410－19104头孢菌素10102乙醇1102310－15第一节酶分离纯化工作的基本原则。3分离纯化过程包括3个基本步骤：1抽提2纯化3制剂6也就是说整个工作包括三个基本环节：抽提(extraction)是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；纯化(puri

3、fication)是要将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；制剂(Preparation)是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。为了能够成功地进行酶的分离纯化，应注意以下问题71．防止酶变性失效(denaturation-deactivation)防止酶的变性失效是酶的分离纯化工作中非常重要的问题，这一点在纯化的后期尤为突出。一般地说，凡是用以预防蛋白质变性失效的方法与措施都应考虑用于酶的分离纯化工作。包括：(1)除了少数例外，所有操作都必须在低温条件下进行，特别是在有机

4、溶剂存在的情况下更应小心；(2)大多数酶在pH<4或pH>10的情况下不稳定，应控制整个系统不要过酸、过碱同时要避免在调整pH时产生局部酸碱过量；481．防止酶变性失效(续)(3)酶和其他蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作时要尽量减少泡沫形成；(4)重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在都能使酶分解破坏，所有这些必须高度重视。9酶不可逆失活的原因和机理10蛋白质不可逆失活的原因蛋白酶水解或自溶作用表面活性剂和去垢剂聚合作用氧化作用机械力变性剂重金属离子和巯基试剂冷冻和脱水热

5、极端pH蛋白质不可逆失活脲和胍高浓度盐螯合有机溶剂辐射作用11蛋白质的稳定化蛋白质稳定化途径如何防止蛋白质的可逆伸展如何防止蛋白质不可逆失活反应发生12稳定蛋白质（酶）的方法132．选择有效的纯化方法理论上，凡用于蛋白质分离纯化的一切方法都同样适用于酶，但实际上，对于酶的分离纯化来说，它还有更大的选择余地。因为：(1)酶纯化的最终目的是要将酶以外的一切杂质(包括其他酶)尽可能地除去，因而，容许在不破坏待纯化的“目的酶”的限度内，使用各种“激烈”手段。(2)由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性，因此可应用各种亲和分离

6、法；而且，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性往往会发生一些有利的变化，这样又扩大了纯化方法与纯化条件的选择范围。5143．酶活性测定贯穿纯化过程的始终应贯穿于整个纯化过程的酶活性测定始终。酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。也就是说，从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较，这样，我们就能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么条件，它们分别使酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而决定其取舍。615第二节酶的抽提抽提的要求

7、是要将尽可能多的酶、尽量少的杂质从原料引入溶液。抽提包括以下环节:716一、预处理和破细胞材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶酶和晶酶）。17微生物胞外酶可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥胞内酶要先收集菌体，经细胞破碎后提取18动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织等植物材料应去皮等以免单宁等物质着色污染19酶，根据它的分布可分为细胞内酶(intracellularenzyme)和细胞外酶(excellularenzyme)。细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题；而细胞内

8、酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。“周质酶”(Periplasmicenzyme)通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就可释放。“膜结合酶”(membrance-bindingenzyme)则往往还有一个切断酶