最新蛋白质的定量测定方法教学讲义ppt课件.ppt

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1、蛋白质的定量测定方法一、Folin酚试剂法(Lowry法)【实验目的】1.学习Folin酚试剂法测定蛋白质含量的原理。2.掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。【实验原理】蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质Cu2+复合物；第二步：蛋白质Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。【实验原理】该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，

2、蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(525μg)在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。二、紫外吸收法【实验目的】1.学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。2.掌握紫外分光光度计的操作方法。【实验原理】大多数蛋白质分子结构

3、中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。【实验材料】1.实验器材试管及试管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度计。2.实验试剂(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／mL的酪蛋白溶液。(2)样品溶液：配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。

4、【实验操作】1.绘制标准曲线取7支试管按下列各表加入各试剂：试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制出标准曲线。2.测定未知样品取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下测定其光密度值。【实验结果】根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。三、微量凯氏定氮法【实验目的】学习凯氏定氮法的原理和操作技术。【实验原理】凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中

5、蛋白质的含量。当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度

6、为止。根据所用标准盐酸的量可计算出待测物中的总氮量。蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。【实验材料】1.实验器材微量凯氏定氮仪1套；50mL凯氏烧瓶4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃珠2.试验试剂(1)浓硫酸；30％氢氧化钠溶液；2％硼酸溶液；标准盐酸溶液(0.01mol／L)。(2)粉末硫酸钾—硫酸铜混合物：K2SO4与CuSO4∙5H2O以3：1配比研磨混合。(3)混合指示剂(田氏指示剂)：由50mL0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL

7、0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。(4)样品溶液：配制3mg/mL的牛血清白蛋白溶液作为样品。【实验操作】1.安装凯氏定氮仪。2.消化：取4个50ml凯氏烧瓶并标号,各加1颗玻璃珠，在1号及2号瓶中各加样品1mL，催化剂(K2SO4CuSO4∙5H2O)200mg，浓硫酸5mL。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3号及4号瓶中各加1mL蒸馏水和与1、2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照。在通风橱内进行消化。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强

8、火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。撤掉火力，冷却至室温。【实验操作】3.蒸馏：(1)蒸馏器的洗涤：用水洗涤干净微量凯氏定氮仪，在蒸汽发生器中加入用几滴硫酸酸化的蒸馏水和几滴甲基红指示剂，用这样的水蒸气洗涤凯氏定氮仪。约15分钟后，在冷凝器下端倾斜放好装