蛋白质定量测定技术课件.ppt

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1、蛋白质定量测定技术本章内容总蛋白质测定的基本原理与方法白蛋白的测定球蛋白的测定临床检验中测定蛋白质的几种情况测定血清总蛋白蛋白质电泳以获取各类蛋白质所占比例测定个别蛋白质蛋白质测定的基础重复的肽键结构蛋白质中所含的酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外吸收与色素的结合能力沉淀后的浊度或光折射改变（上述原理不但适合于总蛋白质的测定，也可用于分离出来的蛋白质组分的测定）凯氏定氮法假设：纯蛋白质，含氮量为16％操作步骤：高温,浓酸OH-蛋白质（N）——NH4＋——NH3——硼酸吸收——用酸碱滴定或纳氏试剂测定氮含量——按6.25g蛋白质/1g氮计算蛋白质含量双缩脲法（Biure

2、t）临床上首先推荐的蛋白质定量方法,操作简便快速，不同蛋白质之间差异小。蛋白质中的肽键（－CONH－）在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物。此反应同两个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应形似，故称为“双缩脲反应”至少含有两个－CONH－基团才能反应，故二肽与氨基酸上述现象酚试剂法（Lowry法）蛋白质中肽键（烯醇化肽键）与Cu2＋络合，释放电子。电子使酚试剂（磷钨酸和磷钼酸）还原蛋白质中酪氨酸、色氨酸以及半胱氨酸、组氨酸能使磷钨酸和磷钼酸同时失去氧原子而还原磷钨酸和磷钼酸还原后生成蓝色混合酸。本法灵敏，受多种还原性物质干扰，不同蛋白

3、质之间差异大BCA法BCA:Bicinchoninicacid，二喹啉甲酸与Lowry法相似，灵敏度相近，但BCA在碱性条件下更稳定在碱性条件下与Cu2+络合，同时将其转变为Cu＋，后者能与BCA反应形成强的紫色，在562nm测定可反映蛋白质的浓度呈色的深浅除与蛋白质浓度相关外，还与反应温度有关，样品中葡萄糖与蔗糖会干扰反应紫外分光光度法（I）（Ultravioletabsorptionspectrophotometry）蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基含有共轭双键，在280nm处有吸收峰蛋白质中肽键在220nm左右存在光吸收生物样品中常混有核酸，其最大吸收峰在2

4、60nm，因此需进行校正本法灵敏，样本可回收再利用，但不同蛋白质之间差异大，且游离酪氨酸、色氨酸、尿酸和胆红素等也存在紫外光吸收紫外分光光度法（II）Lowry－kaleker公式蛋白质浓度(mg/m)=1.45A280-0.74A260Warburg－Christian公式蛋白质浓度(mg/m)=1.55A280-0.76A260Waddell公式蛋白质浓度(mg/m)=144×（A215-A225）染料结合法（I）（dyeconjugation）酸性环境中蛋白质分子可解离出带有正电荷的-NH3+基团，它可与阴离子的染料产生颜色反应，与同样处理的标准溶液比较即可求得

5、样品中蛋白质的含量染料有CBBG-250、丽春红S、邻苯三酚红－钼酸钠、银、胶体金等染料结合法（II）血清总蛋白测定最常用的染料是考马斯亮蓝G-250（CBBG-250），即Bradford法在酸性条件下，CBBG-250与蛋白质结合后由棕红色变为蓝色，最大光吸收从465nm移至595nm本法简便快速，重复性好，灵敏度高，但特异性不高，MW大于3000的多肽也参与反应，强碱和去垢剂会影响呈色，白、球蛋白呈色强度不同几种方法的比较方法灵敏度化学干扰不同蛋白质间差异快速性与复杂性双缩脲100μg中等小快速简易酚试剂1μg严重大较复杂CBBG-2501μg大快速简单紫外分光光

6、度法10μg较严重大快速简单比浊法（turbiditymethod）某些强酸（三氯醋酸、磺基水杨酸等）能与生物碱结合而沉淀，称为生物碱试剂。它们也能与蛋白质结合产生沉淀在酸性溶液中蛋白质带有正电荷，可与带负电荷的生物碱试剂结合形成细微沉淀，经测定悬浮液的浊度，与同样处理的蛋白质标准品比较，即可求得样品中蛋白质的含量此法操作简便，试剂易得，但浊度强弱受多种因素影响折光测定法（ratioofrefraction）溶解在溶液中的固体可以增加溶液的光折射，通过测定血清的折射指数可以计算出总固体的含量由于每升正常血清中含有约16g非蛋白固体，它们对折射指数的影响必须进行校正折

7、射率＝1.3353＋蛋白质浓度（g/dl）×0.00191此法准确性较差，且白、球蛋白的折射率不同OPA荧光法OPA：o-phthalaldehyde,o-苯二醛在巯基乙醇存在条件下，OPA与主胺发生反应生成一种具有强烈蓝色荧光的物质，其最大激发波长为340nm，发射波长为455nm。本法灵敏度高，线性范围广白蛋白测定白蛋白是血清中含量最多的蛋白质将白、球蛋白分离后测定：盐析法不分离白、球蛋白直接测定：染料结合法盐析（saltprecipitation）是一种将蛋白质从溶液中沉淀的方法将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等中性盐加入蛋白质溶液，破坏