蛋白质的定量测定folin-酚法课件

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1、重庆师范大学蛋白质的定量测定——Folin-酚法重庆师范大学目的要求(1)学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法;(2)制备标准曲线,测定未知样品中蛋白质含量。重庆师范大学实验原理Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠,氢氧化钠,硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下,与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用,生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸,硫酸,溴等组成。此试剂在碱性条件下,易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应,其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。重庆师范大学试剂和器材一、试剂Folin

2、—酚试剂:试剂甲:1)4%碳酸钠溶液2)0.2mol/L氢氧化钠溶液3)1%硫酸铜溶液4)2%酒石酸钾钠溶液。临用前将(1)与(2)等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。(3)与(4)等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合,即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制,一天内有效。重庆师范大学试剂和器材试剂乙:称钨酸钠(Na2WO2•2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)25g置2000ml磨口回流装置内,加蒸馏水700ml,85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。充分混匀,使其溶解。小火加热,回流10h(烧瓶内加小玻

3、璃珠数颗,以防溶液溢出),再加入硫酸锂(LiSO4)150g,蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min,以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml,过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液,此液应为鲜黄色,不带任何绿色。置棕色瓶中,可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久,颜色由黄变绿,可加几滴液溴,煮沸几分钟,恢复原色仍可继续使用。重庆师范大学试剂和器材二、标准蛋白质溶液1.标准蛋白质溶液结晶牛血清白蛋白或酪蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量,根据其纯度配制成250ug/ml蛋白溶液重庆师范大学试剂和器材三、器材试管及试管架;0.5,1,及5ml

4、移液管,恒温水浴,分光光度计。重庆师范大学操作方法一、制作标准曲线取试管,按下表操作:试管编号试剂处理123456未知样品标准蛋白质溶液/ml00.20.40.60.81.01.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.200Folin-酚甲试剂/ml5.05.05.05.05.05.05.0摇匀,于20—25℃放置10minFolin-酚乙试剂/ml0.50.50.50.50.50.50.5迅速摇匀,室温20—25℃水浴保温30min,在500nm*处比色500重庆师范大学注意事项(1)Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定,而Folin-酚甲试剂是在碱

5、性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当Folin-酚乙试剂加入后,应迅速摇匀(加一管摇一管),使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。(2)血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内,若超过此范围则需将血清酌情稀释TSGZ0004-2007(1)基本格式统一封面、目录、鉴定评审结论、明细表(2)有关填写要求见附件G43谢谢大家观赏

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