蔗糖酶蛋白含量的测定——folin-酚法

《蔗糖酶蛋白含量的测定——folin-酚法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、专业：姓名：学号：日期：地点：实验报告课程名称：生物化学实验指导老师：成绩：____________实验名称：实验3蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、主要仪器设备（必填）四、操作方法和实验步骤五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析（必填）七、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量；3、掌握分光光度计的使用方法。二、实验内容和原理Folin-酚测定法是在

2、双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L.优点：简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。缺点：该反应受多种因素的

3、干扰。蛋白质(肽键)OHˉ↓甲试剂↓(酒石酸钾钠铜盐)生成紫红色络合物蛋白质中的酪氨酸和色氨酸紫红色络合物OHˉ↓乙试剂↓产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）三、主要仪器设备1、实验材料：蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释。2、实验试剂：⑴标准蛋白质溶液：0.5g/L牛血清白蛋白⑵Folin-酚试剂①甲试剂②乙试剂装订线3、实验器材与仪器1、试管及试管架；2、可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿；3、恒温水浴箱(25℃）。一、操作方法和实验步骤1、制备Folin-酚法蛋白质标准曲线取

4、6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。表1试管号1234560.5g/L标准蛋白质溶液（ml）00.20.40.60.81蒸馏水（ml）10.80.60.40.20Folin-酚试剂甲（ml）555555 混匀，在室温(25℃）下静置10minFolin-酚试剂乙（ml）0.50.50.50.50.50.5混匀，在室温下静置20minA500nm     2、各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶

5、提取分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋白质含量A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。取13支试管，编号1～13，按表2依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。表2样品空白I(1:20稀释)Ⅱ(1:15稀释)Ⅲ(1:10稀释)Ⅳ(原液)编号12345678910111213样品液V(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.5水(ml)1.00.950

6、.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5Folin－酚甲试剂(ml)5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0 混匀后，室温（25℃）放置10分钟Folin－酚乙试剂(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5混匀后，室温（25℃）放置20分钟A500nm      3、绘制标准曲线并计算⑴绘制标准曲线：以光吸收值（A500nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/L）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。⑵计算：蔗糖酶提取

7、分离纯化的样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀释溶液的光吸收值（A500nm），查蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量，再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。一、实验数据记录和处理表1数据试管号123456A500nm0.0000.1170.2420.3300.4470.558蛋白质浓度（g/L）00.01540.03080.04620.06150.0769表2数据(蛋白质浓度根据x=｛(y-0.0059)/7.187｝*6.5/V得出)样品空白I(1:20稀释)Ⅱ(1:15稀释)Ⅲ(1:10稀释)Ⅳ(原液)编号1234567891

8、0111213样品液V(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.5A500nm0.0000.1300.5400.9110.0690.2430.5380.0900.3790.7170.1070.3960.686蛋白