folin-酚试剂法测蛋白质含量测定实验报告

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1、WORD文档下载可编辑生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心专业技术资料分享WORD文档下载可编辑实验名称Folin-酚试剂法测蛋白质含量测定实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。2

2、、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。二、实验原理Folin-酚反应是利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。为了提高该反应的敏感度，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应。1、双缩脲反应：在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用

3、生成紫红色的蛋白质-Cu2+复合物。2、Folin-酚显色反应：蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。即根据预先绘制的标专业技术资料分享WORD文档下载可编辑准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。三、材料与方法：以流程图示意1、材料：样品：健康人的血清（稀释300倍）试剂：牛血清蛋白标准液（200μg/ml）、碱性的硫酸铜溶液、蒸

4、馏水、Folin-酚试剂仪器及器材：V-1100型分光光度计、恒温水浴箱、试管6只、试管架、加样枪、加样枪架、加样枪头2、方法：反应体系设置双缩脲反应Folin-酚反应比色测定试剂（ml）123456牛血清蛋白标准液-0.20.40.60.8-样品液（稀释300倍）-----0.5蒸馏水1.00.80.60.40.20.5碱性硫酸铜溶液2.02.02.02.02.02.0蛋白质的含量（μg/ml）04080120160待测①　取6支试管编号1~6，按下表依次加入试剂并混匀，室温放置10min。表格1Folin

5、-酚试剂定量蛋白质实验步骤②　往6支试管中分别加入Folin-酚试剂0.20ml，在2s内立即混匀。40℃水浴加热10min后，冷却至室温。③　用V-1100型分光光度计以500nm波长比色，用1号管做空白，测量各管吸光度值并记录，每管测量3次。④　数据处理，绘制标准曲线，计算实验结果。四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。1、结果①　实验现象：1)加入蒸馏水、蛋白样品和碱性硫酸铜溶液后，溶液均呈无色。专业技术资料分享WORD文档下载可编辑1)加入Folin

6、-酚试剂后，溶液均呈黄色。图1水浴前各试管溶液颜色2)水浴后，1号试管溶液呈无色。2号试管到5号试管溶液呈蓝色，且颜色逐渐加深。6号试管溶液颜色介于4号与5号之间，更接近于5号。图2水浴后各试管溶液颜色①　实验数据记录与分析测定次数各管A值2345610.0500.0880.1280.1440.14220.0490.0850.1250.1440.14230.0470.0840.1240.1430.142专业技术资料分享WORD文档下载可编辑各管平均值0.0490.0860.1260.1440.142表格250

7、0nm波长吸光度值记录12345C（μg/ml）04080120160A（吸光度）00.0490.0860.1260.144表格3绘制标准曲线数据表标准曲线图①　实验结果计算：由标准曲线图可得，标准曲线方程为y=0.001x。由实验测得样品管（6号试管）的吸光度为0.142，即y6=0.142，代入标准曲线方程中可求得C6’=0.142/0.001=142μg/ml。即样品管中的蛋白质浓度为142μg/ml。由于血清被稀释了300倍，在实验中根据化学定量原则再稀释2倍。因此，健康人血清中蛋白质浓度C6=142

8、*300*2=85200ug/ml=85.200g/L。最终通过实验测得健康人血清中蛋白质浓度为85.200g/L。2、分析①　最终实验结果超出正常范围（正常人血清蛋白浓度范围为60~80g/L）。可能的原因有：专业技术资料分享WORD文档下载可编辑1）酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用,导致蛋白质偏高。2）实验操作不当。3）从标准曲线图来看，前四个点基本在一条直