3 蛋白质浓度的测定(Folin-酚试剂法)

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1、中国海洋大学实验报告姓名庞裕智专业年级生命基地班2011题目蛋白质浓度的测定（Folin-酚试剂法）学号040312011025科目生物化学实验时间周一90节同组者田特一、实验目的熟悉并掌握Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。二、实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。三、实验仪器1.卵清蛋白片2.7220分光光度计3.试管4.移液管四、实验试剂1.Folin-酚试剂A：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙

2、液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。临用时按甲：乙=50：1混合使用。2.Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。3.1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋

3、白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml。五、实验步骤1.标准曲线的绘制取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2.样品测定准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。管号1234567样品牛血清蛋白液(1mg/ml)ml蒸馏水mlFolin-酚试剂A00.54.00.050.454.00.10.44.00.20.34.00.30.24.00.40.14.00.504.00.5（样液）04.0摇匀，在室温下放置10分钟Folin-酚试剂B0.50.50.50.50.5

4、0.50.50.5摇匀，在室温下放置30分钟后在640nm下比色OD640六、实验结果管号1234567样品蛋白质浓度（mg/ml）0.000.010.020.040.060.080.10光密度(OD640)0.0000.0700.1020.1690.2240.2830.3650.221由图中曲线，可计算出待测样品蛋白质浓度为0.058mg/ml。七、实验分析此次实验的结果中，R2<0.9900，说明结果不够准确，数据说服力不足，这可能是由于实验过程中操作不当所致。在实验过程中，我们在摇匀时晃动试管十分剧烈，可能有液体溅出。在今后的实验中应尽量注意小心谨慎。1.注意事项（1）Tris缓冲液

5、、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、丙酮……等均会干扰Folin-酚反应。（2）当酚试剂加入后，应迅速摇匀（加—管摇一管）以免出现浑浊。（3）由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红外光区呈现较宽吸收峰区。不同实验室选用不同波长，有选用500或540nm，有选用640nm，700或750nm。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选用波长640nm。2.思考题蛋白质含量测定的方法有哪些，各有什么优缺点？（1）微量凯氏定氮法优点：使用凯氏蒸馏装置，使用方便，效果良好，节省能源；干扰少。缺点：灵敏度低，费时太长。（2）双缩脲法优点：可用于快

6、速测定；硫酸铵不干扰此呈色反应。缺点：结果不十分精确，灵敏度低，不同蛋白质显色相似；铜离子易被还原，有时会出现红色沉淀。（3）Folin－酚试剂法优点：比色法结果较为精确，灵敏度高。缺点：易受干扰，耗时长，操作需要严格计时。（4）紫外光吸收法优点：较为灵敏，快速。缺点：如溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm的吸光度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度；适用对象范围较小。（5）考马斯亮蓝结合法优点：考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应使蛋白质测定的灵敏度最高。缺点：所能测定的范围较小。