最新分子生物学实验设计-蚕豆病课件ppt.ppt

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1、分子生物学实验设计-蚕豆病案例：患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。临床表现：体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。病例样本标准值意义红细胞1.98×1012/L4.3~4.5×1012/L↓血红蛋白53g/L170-200g/L↓血清总蛋白

2、85.5µmol/L5.13~18.8µmol/L↑结合胆红素13.7µmol/L1.71~6.84µmol/L↑未结合胆红素71.8µmol/L3.42~11.96µmol/L↑尿蛋白（++）(－)轻度蛋白尿潜血(+)(－)血管内溶血尿胆红素(－)(－)－尿胆原素(+)少量↑实验室检查：早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾肿大。严重病例可见昏迷

3、、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于1～2日内死亡。主要临床表现：2、设计实验进一步明确诊断。贫血、黄疸有和无遗传史无或有诱因（食用蚕豆、服用药物、感染）体征：脾肿大、黄疸血常规检查血清学检查检查HA的病因G6PD筛选试验G6PD确诊试验Hb↓、网织红细胞↑间接胆红素↑尿胆原↑游离Hb↑结合珠蛋白↓怀疑其他HA,相应病因检测结果正常G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定G6PD基因分析其他筛选试验高铁血红蛋白还原试验初诊或确诊G6PD缺陷症确诊溶贫（血管内溶血）确诊G6PD做1项或2项做1项高铁血红蛋白还原试验筛选试验→确诊试

4、验G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定实验名称：高铁血红蛋白还原试验实验一实验原理在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）亚铁血红蛋白NADPH(辅酶)亚甲蓝(递氢体)高铁血红蛋白还原酶高铁血红蛋白（实验方向）0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖

5、溶液①、0.4mmol/L亚甲蓝溶液②、0.28mol/L葡萄糖溶液③、混合液（等量①+②+③）、生理盐水、抗凝剂紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支主要试剂和仪器主要试剂：仪器：实验操作流程取静脉血1.8mL于抗凝管，混匀抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝剂+葡萄糖20mg)离心沉淀1000r/min15min调整血细胞∶血浆=1∶1，混匀→调整后全血（备用）1ml0.18mol/L亚硝酸钠1ml0.28mol/L葡萄糖溶液1ml0.14mmol/L亚甲基蓝液混匀→混合试剂（备用）取试管3支,标上A、B、S,按下表加入

6、试剂高铁血红蛋白还原试验操作步骤混合试剂/mL0.01//生理盐水/mL/0.01/0.18mol/L亚硝酸钠-//0.010.28mol/L葡萄糖溶液/mL经调整的全血/mL0.10.10.1来回摇动15～20次,置37℃水浴箱静置3h蒸馏水10.00ml10.00ml10.00ml试剂ABSB管为空白管,在波长635nm处，测定“A”管及“S”管吸光度计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb%=(1-A/S)×100%注意事项1、血细胞比容比值过低，高铁血红蛋白还原率降低。应将血细胞比容调整到0.35-0.402、细菌污染可产生亚硝

7、酸盐而造成假阳性，试管等应无菌3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果，故应2h内送检4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较全血缺乏结果分析方法正常值：MHb还原率>=75%，脐血>=77%临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者：MHb还原率<30%脐血<40%杂合子患者：MHb还原率<31%~74%脐血<41%~76%实验二G6PD荧光斑点试验实验原理葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下

8、产生荧光（反应原理如下图）。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性G6P6PGAG6PDNADPNADPH反应液：G-6-P液1份、NADP液1