分子生物学实验设计-蚕豆病.ppt

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1、★年级、专业、班级：★实验课时间：★实验室：★组别：第一组★组员：★报告人：案例：患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。临床表现：体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。病例样本标准值意义红细胞1.98×1012/L4.3~4.

2、5×1012/L↓血红蛋白53g/L170-200g/L↓血清总蛋白85.5µmol/L5.13~18.8µmol/L↑结合胆红素13.7µmol/L1.71~6.84µmol/L↑未结合胆红素71.8µmol/L3.42~11.96µmol/L↑尿蛋白（++）(－)轻度蛋白尿潜血(+)(－)血管内溶血尿胆红素(－)(－)－尿胆原素(+)少量↑实验室检查：1、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？2、请设计实验进一步明确诊断。3、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。必答题：5、患者

3、体型瘦小与该病症是否有关，为什么？选答题：恶心、呕吐、面色苍白皮肤及巩膜黄染红细胞1.98×1012/L血红蛋白53g/L血清总胆红素85.5µmol/L尿蛋白（++）尿胆红素(－)尿胆素原(+)尿液镜下未见红细胞黄疸红细胞膜不完整，已破裂红细胞含量少含量明显增加血红蛋白量减少排尿呈酱油样色游离胆红素增加溶血性黄疸初步诊断为：红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症（蚕豆病）肠肝循环增多1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？症状正常红细胞溶血性贫血红细胞蚕豆病简介蚕豆病是一种6-磷

4、酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。易发人群多见于儿童，男性患者约占90%以上。发病机制G6PD↓→NADPH+H+↓→GSH↓→红细胞的抗氧化能力↓发生溶血左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功

5、能异常，约50%患者脾肿大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于1～2日内死亡。主要临床表现：2、设计实验进一步明确诊断。贫血、黄疸有和无遗传史无或有诱因（食用蚕豆、服用药物、感染）体征：脾肿大、黄疸血常规检查血清学检查检查HA的病因G6PD筛选试验G6PD确诊试验Hb↓、网织红细胞↑间接胆红素↑尿胆原↑游离Hb↑结合珠蛋白↓怀疑其他HA,相应病因检测结果正常G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定G6PD基因分析其他筛选试验高铁血红蛋白还原试验初诊或确诊G6PD缺陷症确诊溶贫（血管内溶血）确诊

6、G6PD做1项或2项做1项高铁血红蛋白还原试验筛选试验→确诊试验G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定实验名称：高铁血红蛋白还原试验实验一实验原理在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）亚铁血红蛋白NADPH(辅酶)亚甲蓝(递氢

7、体)高铁血红蛋白还原酶高铁血红蛋白（实验方向）0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、0.4mmol/L亚甲蓝溶液②、0.28mol/L葡萄糖溶液③、混合液（等量①+②+③）、生理盐水、抗凝剂紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支主要试剂和仪器主要试剂：仪器：实验操作流程取静脉血1.8mL于抗凝管，混匀抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝剂+葡萄糖20mg)离心沉淀1000r/min15min调整血细胞∶血浆=1∶1，混匀→调整后全血（备用）1ml0.18mol/L亚硝酸钠1ml0.28mol/L葡萄糖溶

8、液1ml0.14mmol/L亚甲基蓝液混匀→混合试剂（备用）取试管3支,标上A、B、S,按下表加入试剂高铁血红蛋白还原试验操作步骤混合试剂/mL0.01//生理盐水/mL/0.01/0.18mol/L亚硝酸钠-//0.010.28mol/L葡萄糖溶液/mL经调整的全血/mL0.10.10.1来回摇动15～20次,置37℃水浴箱静置3h蒸馏水10.00ml10.00ml10