最新分子生物学实验设计-蚕豆病教学讲义PPT课件.ppt

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1、分子生物学实验设计-蚕豆病案例：患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。临床表现：体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。病例样本标准值意义红细胞1.98×1012/L4.3~4.5×1012/L↓血红蛋白53g/L170-200g/L↓血清总蛋白85.5µmol/L5.13~18.8µmol/L↑结合

2、胆红素13.7µmol/L1.71~6.84µmol/L↑未结合胆红素71.8µmol/L3.42~11.96µmol/L↑尿蛋白（++）(－)轻度蛋白尿潜血(+)(－)血管内溶血尿胆红素(－)(－)－尿胆原素(+)少量↑实验室检查：早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾肿大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于1～2日内死亡。主要临床表现：2、设计实验进一步明确诊断。贫血、黄疸有和无遗

3、传史无或有诱因（食用蚕豆、服用药物、感染）体征：脾肿大、黄疸血常规检查血清学检查检查HA的病因G6PD筛选试验G6PD确诊试验Hb↓、网织红细胞↑间接胆红素↑尿胆原↑游离Hb↑结合珠蛋白↓怀疑其他HA,相应病因检测结果正常G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定G6PD基因分析其他筛选试验高铁血红蛋白还原试验初诊或确诊G6PD缺陷症确诊溶贫（血管内溶血）确诊G6PD做1项或2项做1项高铁血红蛋白还原试验筛选试验→确诊试验G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定实验名称：高铁血红蛋白还原试验实验一实验原理在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁

4、血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）亚铁血红蛋白NADPH(辅酶)亚甲蓝(递氢体)高铁血红蛋白还原酶高铁血红蛋白（实验方向）0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、0.4mmol/L亚甲蓝溶液②、0.28mol/L葡萄糖溶液③、混合液（等量①+②+③）、生理盐水、抗凝剂紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支主要试剂和仪器主要试剂：仪器：实验操作流程取静脉血1.8mL于抗凝管，混

5、匀抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝剂+葡萄糖20mg)离心沉淀1000r/min15min调整血细胞∶血浆=1∶1，混匀→调整后全血（备用）1ml0.18mol/L亚硝酸钠1ml0.28mol/L葡萄糖溶液1ml0.14mmol/L亚甲基蓝液混匀→混合试剂（备用）取试管3支,标上A、B、S,按下表加入试剂高铁血红蛋白还原试验操作步骤混合试剂/mL0.01//生理盐水/mL/0.01/0.18mol/L亚硝酸钠-//0.010.28mol/L葡萄糖溶液/mL经调整的全血/mL0.10.10.1来回摇动15～20次,置37℃水浴箱静置3h蒸馏水10.00ml10.00ml10.0

6、0ml试剂ABSB管为空白管,在波长635nm处，测定“A”管及“S”管吸光度计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb%=(1-A/S)×100%注意事项1、血细胞比容比值过低，高铁血红蛋白还原率降低。应将血细胞比容调整到0.35-0.402、细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等应无菌3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果，故应2h内送检4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较全血缺乏结果分析方法正常值：MHb还原率>=75%，脐血>=77%临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者：MHb还原率<30%脐血<40%杂合子患者：MHb还原率<31%

7、~74%脐血<41%~76%实验二G6PD荧光斑点试验实验原理葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性G6P6PGAG6PDNADPNADPH反应液：G-6-P液1份、NADP液1