蚕豆病实验设计.ppt

《蚕豆病实验设计.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、临床十二大班9人组2012级本科分子生物学实验设计案例患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.

2、5µmol/L，结合胆红素13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。案例分析1、恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，脸色苍白，皮肤及巩膜黄染（伴有溶血性黄疸）2、心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常（症状不严重）案例分析3、血象红细胞1.98×1012/L（↓）﹤4.0～5.5﹥×1012/L血红蛋白53g/L（↓）（110-150G/L）血清总胆红素85.5µmol/L（↑）1.7

3、1-17.1μmol/L4、尿常规尿液下未见红细胞（红细胞膜已不完整）尿胆素原呈阳性轻度蚕豆病并伴溶血性黄疸根据以上信息和检查诊断蚕豆病简介蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。多见于儿童，男性患者约占90%以上。临床表现早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性

4、贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于1～2日内死亡。红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定（紫外法）设计实验进一步明确诊断实验原理●要检测G6PD的活性，可以检测NADPH生成量实验原理●已知：NADPH在340nm的紫外线照射下产生荧光即可以每隔2分钟在340nm波长下测定孵育液中NADPH吸光度以10min吸光度值的变化（△A340）计算NADPH的产量。实验原理还原型谷胱甘肽使高铁血红蛋白还原为血

5、红蛋白2G-SHMHbHbG-S-S-GNADP+NADPH●即可以检测血红蛋白的含量实验器材和试剂1.实验器材恒温水循环紫外分光光度计，可见分光光度计，离心机。2.试剂（1）0.5mol/LTris-HClMgCl2缓冲溶液（pH8.0）：称取Tris12.1g,MgCl2·6H2O4.06g,加入160mL蒸馏水溶解，用HCl调pH至8.0，然后加入蒸馏水至200mL。（2）2mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP＋)：称取NADP＋21.3mg，溶于10mL蒸馏水中。4℃可保存20天

6、左右。（3）6mmol/L葡萄糖—6—磷酸二钠(G6P－Na2)：称取21.5mgG6P－Na2·2H2O，溶于10mL蒸馏水中。4℃可保存20天左右。（4）溶血剂：取巯基乙醇0.1mL，10%EDTA2.0mL，6mmol/LNADP＋0.4mL，加蒸馏水至总体积200mL。（5）血红蛋白氧化剂（Drabkin试剂）：称取K3Fe(CN)60.2g，KCN0.052g，NaHCO31.0g，加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶内避光保存，可保存20天。（6）0.9%NaCl，ACD抗凝剂。实验器材和

7、试剂实验操作流程1、洗涤红细胞取静脉血2.0mL，放入含0.4mLACD抗凝剂的试管中，混匀。吸取0.2mL抗凝血放入试管中，加入4mL预冷的生理盐水，轻轻摇匀，2500r/min离心5min,倾去上清，重复三次。2、溶血液的制备向红细胞沉淀中加入溶血剂2.0mL，震荡1min，4℃放置10min以上。3、NADPH的测定取石英比色杯两只，标为“测定”及“空白”，按下表操作：试剂体积蒸馏水（uL）0.5mol/LTris-HClMgCl2缓冲溶液（uL）6mmol/LG6P-Na2(uL)2mmo

8、l/LNADP+(uL)2040300300300混匀后放入带恒温水循环（25℃）的紫外分光光度计中，预热10min然后在“测定”中加入溶血液60uL,“空白”中加入溶血剂60uL，混匀以“空白”调“0”,1min后开始测340nm吸光度（A340），每2min纪录吸光度一次，至10min止，比较每2minA值的变化情况，若相近则表明酶促反应平稳。以10minA值的变化（△A340）计算NADPH的产量。4.溶血液中血红蛋白含量的测定取试管一支，按下表操作：试剂体积Drabkin(