猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白7α(NSP7α)三维结构的解析和其功能的初步研究.docx

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1、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）非结构蛋白7α(NSP7α)三维结构的解析和其功能的初步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）是一种正链单股RNA病毒,它引起的猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是全世界养猪产业中最有危害性的疾病之一。研究表明PRRSV的非结构蛋白7（NSP7）参与到了体液免疫反应中并与PRRSV感染的猪血清有强烈的反应。NSP7有一个内部的蛋白酶酶切位点,可使其在蛋白酶的作用下被剪切成NS

2、P7α和NSP7β。本研究应用抗NSP7α和NSP7β的抗血清检测了这两种非结构蛋白在病毒感染的细胞中的表达情况;应用核磁共振（NMR）解析了溶液中PRRSVNSP7α的结构,并将该结构与其同源蛋白EAVNSP7a的结构进行了比对分析;确定了NSP7α和PRRSV的RNA依赖性RNA聚合酶（NSP9）之间的互作关系,并在NSP7α三维结构的基础上预测并鉴定了位于NSP7α上与NSP9互作的关键氨基酸。这些结果为在后续实验中探究NSP7α的功能及PRRSV侵染细胞的机制提供了新的思路。本论文包括以下几个方面的内容:1.以原核表达的蛋白NSP7α和NSP7β分别免疫家兔制作多克隆抗体,并

3、通过Westernblot分别检测了两个蛋白在感染PRRSV后不同时间点的MARC-145细胞及PRRSV的天然宿主细胞猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中的表达。随后以感染PRRSVMARC-145细胞为样品,通过免疫荧光技术检测了NSP7α和NSP7β及其前体蛋白在细胞中的分布情况。在Westernblot实验中抗NSP7α的抗血清检测到了与NSP7α大小相近的条带和若干与NSP7的前体蛋白大小相近的条带。但是没有检测到与NSP7大小相近的条带。同时抗NSP7β的抗血清虽然也检测到了若干与NSP7前体蛋白大小相近的条带,但是没有检测到与NSP7或NSP7β大小相近的条带。免疫荧光实验显示

4、抗NSP7α的抗血清检测到NSP7α和NSP7的前体蛋白的荧光信号分布于被感染细胞的细胞质中,这表明NSP7α和NSP7的前体蛋白只是参与了细胞质中的生理反应。2.应用液态NMR技术对溶液中NSP7α进行了结构解析。本研究应用原核表达系统表达了同位素¹³C和¹⁵N标记的NSP7α,采集了该蛋白的NMR谱,进而完成了对全蛋白的化学位移的归属并在此基础上解析出了蛋白质三维结构。通过与同源蛋白EAVNSP7a的序列和结构进行比对分析发现二者的二级结构有着相似的空间分布,并且它们的α螺旋2到α螺旋3的部分是重合性最好的区域。3.应用酵母双杂交检测N

5、SP7α与PRRSV各非结构蛋白的互作关系,结果表明NSP7α只与NSP9发生互作。为了进一步对结果进行验证,随后采用Pull-down和双分子荧光互补技术证实了NSP7α与NSP9的互作关系。NSP9是PRRSV中依赖RNA的RNA聚合酶,也是病毒在复制过程中的复制-转录复合体（RTC）的重要组成部分,NSP7α与NSP9的互作表明NSP7α的功能与病毒的复制可能是相关的,并且它还可能参与到了RTC中并且/或者辅助NSP9来完成RNA的合成。基于NSP7α的三维结构,预测出了NSP7α与NSP9互作的关键位点。最后通过单点突变体分析和Pull-down技术对预测到的位点进行了鉴定并

6、最终确定了NSP7α上的L69和F72为影响NSP7α与NSP9互作的关键氨基酸。