《细胞mirna抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）复制的相关研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
'玲掛I;，•V;擊:论文编号」.t'W..—乂K忍：■囯农学院..‘」..二♦•<、’；...■■'、-'丨讓徽；■-_位论文，；：•，心：、•-.〜:、细雎miRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PIHEliSV)复餺的相矣研究c兔，工乂:乂StudyontheSuppressionofPorcineReprodactiveandRespiratorySyndromeVirusReplicationbyCelluarmIRNAs蠢-^-V-V：.博士研究生：李丽l指导教师:童光志申请学位类另ih农学傅壬、;卜•‘:业：预防兽医学.:卜翁:t•狗研费培:；：辱、、单々位：上寧兽禪•究所4…V:」舊必:A吩…，:'八''•2灰5年5月、J'■■-：.：""V^7.Iv"；T.^：^：••••.痛: 独创性声明本人声明所y交的论文是我个人在导师指导下进行的研究I:作及収得的研究成Ig我所知.除了义屮特别加以标注和致谢的地方外，论文屮小liAil他人Ll行.发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教f'y机构的学位成丨|_丨-:书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：夕年^>^|丨关于论文使用授权的声明本人Vi全了解屮W农业科学院有关保留、使用学位论文的规定.即：中W农、丨k/科保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，町以采川影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院讨以川式/I-M、同媒休上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目细胞miRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的相关研究兽医微生物论文作者李丽薇专业预防兽医学研究方向及其分子生物学指导教师童光志培养单位（研究所、中心）±^rnm姓名职称单位专业盲评评阅盲评人盲评Ma辩主席周继勇浙江大学微生物学秦爱建教授扬州大学预防兽医学孙建和教授上海交通大学预防兽医学答丁铲研究员上海兽医研究所预防兽医学辩李泽君研究员上海兽医研究所预防兽医学委刘光清研究员上海兽医研究所预防兽医学员李国新研究员上海兽医研究所预防兽医学会议记录（秘书）顾惠明论文答辩时间地点2015年5月25日上海兽医研究所 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文细胞miRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制的相关研究StudyontheSuppressionofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusReplicationbyCelluarmiRNAs博士研究生：李丽薇指导教师：童光志申请学位类别：农学博士专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物及其分子生物学培养单位：上海兽医研究所研究生院2015年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationStudyontheSuppressionofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusReplicationbyCelluarmiRNAsPh.DCandidate:LiweiLiSupervisor:Prof.GuangzhiTongMajor:PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyMay2015 摘要猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）可引起母猪晚期流产和仔猪呼吸疾病等临床症状。由于该病的病原猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）具有较高的变异性，且可造成持续性感染和免疫抑制，因而疫苗免疫防控比较困难。近年来，越来越多的证据表明宿主细胞microRNA（miRNA）是机体先天性/获得性免疫以及宿主-病原体相互作用的复杂网络中不可或缺的调节因子。通过直接结合病毒RNA抑制基因表达或间接作用于某个细胞成分进而影响细胞内通路和调节先天性免疫应答，miRNA在抗病毒感染和复制方面也扮演了重要的角色。为筛选具有抑制PRRSV复制潜在功效的miRNA，我们合成了15条miRNA模拟物，其序列在不同物种之间具有高度保守性，且已有相关文献表明它们在先天性免疫和/或抗病毒方面具有一定功效。本研究利用体外转染miRNA模拟物或阴性对照后再感染相同剂量病毒的方法鉴定具有抗PRRSV作用的miRNA，并从病毒学水平、基因组复制水平和蛋白翻译水平证明其抑制作用，并进一步发掘其发挥作用的机制。结果表明，15条候选miRNA中仅有miR-26a可以强烈抑制PRRSV的复制。体外过表达miR-26a对不同毒力、不同基因型的PRRSV毒株均有抑制作用，且作用的强弱与转染剂量在一定范围内呈正相关。突变miR-26a种子区（SeedRegion）可恢复病毒滴度，然而突变种子区以外局域并不影响其抑制作用。通过荧光素酶报告基因试验，我们发现miR-26a不能直接作用于PRRSV基因组RNA。另一方面，过表达miR-26a可以显著上调I型干扰素和干扰素刺激基因MX1、ISG15的表达，这表明miR-26a可能通过调控I型干扰素通路进一步发挥抗PRRSV感染作用。随后，我们利用生物信息学软件预测了PRRSVvJX143基因组上潜在的miRNA靶位点，结果发现其5’末端第155-162位核苷酸与miR-130种子区以7mer-m8的结合方式完全互补配对。经序列比对分析，其保守性在21株具有代表性的北美型毒株中达100%，而在3株欧洲型毒株中却并不存在。恰如预料的是，转染miR-130家族，尤其是miR-130b可以显著抑制PRRSV的体外复制。我们还发现这种抑制作用表现在多株北美型病毒，而对欧洲株无效。荧光素酶报告试验证明，miR-130b可以显著降低pGL3-5UTR荧光素酶的活性。同时，miR-130b不激活PAM细胞中IFN-α和TNF-α中的表达，揭示miR-130的抗PRRSV作用是通过直接靶向PRRSV特异性的结合位点，而非激活先天性免疫来实现的。另外，作为一种无抗原性的小分子，miRNA被认为在抗病毒治疗应用中具有潜在功效。通过动物体内试验发现，滴鼻给药miR-130b可以明显缓解临床症状和病毒血症，同时形成部分免疫保护效果。本论文的最后部分，我们通过深度测序鉴定了PRRSV感染MARC-145细胞后miRNA表达谱，并进行了差异分析。结果可以看出，类似很多物种，miR-21是MARC-145细胞中含量最丰富的miRNA。PRRSV感染后，可以对MARC-145内源的miRNA表达产生影响。已经确定了多种细胞miRNA，其表达在PRRSV感染后发生显著改变，其中很多miRNA在前人研究中与机体先天性免疫等息息相关。这表明，miRNA可能在PRRSV复制和宿主防御感染中发挥着功能。在PRRSV基因组序列范围内，我们没有找到任何潜在的miRNA茎环结构存在的证据。根据不同miRNA在细胞中的表达量，我们选取了六条分别呈高、中、低丰度表达的miRNA作为研究对象，利用北美型PRRSV全长感染性克隆pAPRRS的平台，将miRNA的反向互补序列插入PRRSV基I 因组3’UTR中，构建了一系列PRRSV突变体，人工提供了与内源性miRNA序列完全互补的结合位点。结果发现，插入let-7e结合位点后，可以在转染后显著抑制病毒产生的时间和复制的速率，但遗憾的是突变病毒遗传不稳定。尽管如此，我们还是获得了一定试验数据，插入互补结合位点也不失为利用内源miRNA抑制PRRSV复制的一个研究思路，可通过更多尝试以寻找一株复制能力较弱且稳定遗传的PRRSV，用于抗病毒治疗的研究。综上所述，本研究为宿主细胞miRNA与PRRSV复制相互作用提供了三方面的试验数据，证实miR-26a、miR-130家族的抗PRRSV作用及其机制，同时构建了PRRSV感染MARC-145细胞后miRNA表达谱，并对利用细胞内源miRNA抑制PRRSV复制的策略进行了初步探索。关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒，miR-26a，miR-130b，miRNA表达谱，病毒复制II AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)ischaracterizedbylatetermabortionsandrespiratorydisease,particularlyinyoungpigs.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV),asthecausativeagentofPRRS,canmutaterapidlyandcausepersistentinfectionandimmunosuppression.Inrecentyears,thereisagrowingbodyofevidencethatcellularmicroRNAs(miRNAs)areimportantregulatorsofinnateandadaptiveimmuneresponsesandtheintricatenetworksofhost-pathogeninteractions.MiRNAsalsorevealbigrolesinviralinfectionsbybindingdirectlytoviralRNAorbymodulatingtheexpressionofcellularfactorsessentialtoviralreplicationorthehostinnateimmuneresponsetoinfection.ToidentifyhostcelluarmiRNAsimportanttocontrollingPRRSVinfection,wescreened15miRNAsthatwerepreviouslyimplicatedininnateimmunityorantiviralfunctions.Over-expressionofthemiR-26familystronglyinhibitedPRRSVreplicationinvitro,asshownbyvirustiterassays,Westernblotting,andqRT-PCRassays.MiR-26ainhibitedthereplicationofbothtype1andtype2PRRSVstrains.MutatingtheseedregionofmiR-26restoredviraltiters.LuciferasereportersshowedthatmiR-26adoesnottargetthePRRSVgenomedirectlybutinsteadaffectstheexpressionoftypeIinterferonandtheIFN-stimulatedgenesMX1andISG15duringPRRSVinfection.OurstudyrevealsanexampleofamiRNAthataffectsviralpropagationandhighlightsahostfactorthatmaybeimportantforfuturecontrolmeasuresagainstPRRS.ThenweperformedcomputationalpredictionanalysisoftheHP-PRRSVstrainvJX143andtheclassicPRRSVstrainvAPRRSusingViTaandmiRandadatabasetopredictmiRNAtargetsitesinordertofindmorepotentPRRSVinhibitors.PredictionresultsindicatedthatmiR-130couldtargetthesites(bp155to162)inviralgenomicRNAthroughseedbasepairing.Itwaspleasantlysurprisingthatthetargetregionwashighlyconservedintype2PRRSV,whichnowcirculatesinmostcommercialswineindustriesthroughouttheworld,butabsentintype1PRRSV.Asexpected,deliveredmiR-130familymimics,especiallymiR-130binhibitedPRRSVreplicationinvitroaccordingtotheresultsofvirustiterassays,IFA,WesternblottingandqRT-PCRassays.Wealsofoundthattheanti-PRRSVeffectofmiR-130isconfirmedinmutipletype2PRRSVstrainsbutnotinvSHE,aclassicaltype1strain.Moveover,over-expressionofmiR-130didnotinduceIFN-alphaorTNF-alphaexpressionineithermock-orPRRSV-infectedPAMs.Luciferasereporterassaysshowedthatrelativeluciferaseactivityproduceda70%decreaseinpGL3-5UTRwhilenodecreaseinrelativeluciferaseactivitywasobservedinanyothervectors.TheresultsaboveindicatedthatmiR-130directlytargetsPRRSVRNA.AsmiRNAsaresmallmoleculeswithoutantigenicproperties,theyareconsideredtohavepotentialefficacyinantiviraltherapeuticapplications.Finally,toaddresswhethermiR-130b-mediatedinhibitionofPRRSVreplicationcanbeusedintherapy,weperformedtheanimalexprimentandtheresultsshowedthatintranasaldeliveryofmiR-130bsignificantlyinhibitedvJX143replicationinpiglets.Theaveragevirusloadinserumwasabout1000-foldlowerthanthatinvJX143-infectedgroup.Surprisingly,in3ofthe4miR-130b-treatedpigs,itappearedthatPRRSVreplicationcouldbecontrolledin21dpi.III Overall,theseresultsdemonstratetheimportantroleofmiR-130familyinmodulatingPRRSVinfectionandalsosupportthepossibilityofusinghostmiR-130btoachieveRNAi-mediatedantiviraltherapeuticstrategies.Inthelastpartofthearticle,weperformeddeepsequencingtoconstructsmallRNAexpressionprofilesfrominvitroculturedPRRSV-infectedMARC-145cellstoindentifytheimpactofPRRSVinfectionsonthecellularmiRNAome.AccordingtotheexpressionofdifferentmiRNAinMARC-145cells,wechosesixmiRNAsofdifferentialexpressionasstudyobjects.BasedonPRRSVfull-lengthcDNAclonepAPRRS,arangeofmiRNAreversecomplementsequencesinsertedmutantsinPRRSV3’UTRwereconstructed,whichprovidedartificialengineeredperfectcomplementarybase-pairingtargetsitesofmiRNAs,andtransfectedintoMARC-145cells.Asaresult,wefoundthatnofluorescentsignalwasdetectedinthecaseofhighexpressionmiRNAtargetmutants,andnoinfectiousparticleswereproducedevenafterthreefurtherpassages.AllthelowexpressionmiRNAtargetvirusesweresuccessfullyrescuedandshowedsimilargrowthpropertytovAPRRS.Interestingly,fluorescentsignalwasdetectedat24hposttransfectioninthecaseofthemediumexpressionmiRNAtargetmutants,butthereisnoinfectiousparticleatthefirst60hposttransfection.Toassesstheirgeneticstability,allrescuedviruseswereseriallypassagedfivetimestoestablishvirusstocksofP1-5virus.ThespontaneousmutationsonlyexistedinthemiRNAtargetsitesinthecaseofthemediumexpressionmiRNAtargetrescuedvirus,whichindicatedthereasonofearlyrepressionofvirusreplication.ThisapproachprovidesageneralmicroRNA-basedgenesilencingstrategyforinhibitingPRRSVreplicationbyharnessingendogenousmiRNAs.Insummary,ourworkprovidesevidencefortheimportantroleplayedbyhostmiRNAsinmodulatingPRRSVreplicationbothundercelluarandnaturalconditionsandalsoimpliesthatcellularmiRNAscanbeconsideredtherapeutictoolsforantiviraltherapyinthefuture.Keywords:PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus(PRRSV),miR-26a,miR-130b,microRNAome,virusreplicationIV 目录第一章绪论.....................................................................................................................11.1猪繁殖与呼吸综合征病毒概述.............................................................................11.2PRRSV病原学研究进展........................................................................................11.2.1PRRSV基因组结构......................................................................................11.2.2PRRSV基因组复制与亚基因组转录..........................................................21.2.3PRRSV非结构蛋白与结构蛋白..................................................................31.2.4PRRSV细胞嗜性与入侵..............................................................................51.3PRRSV持续性感染与先天性免疫........................................................................61.4MicroRNA研究概述...............................................................................................81.4.1MicroRNA的发现与定义.............................................................................81.4.2MicroRNA的生物学发生.............................................................................81.4.3MicroRNA的作用特征.................................................................................91.5MicroRNA识别及靶基因预测.............................................................................121.6宿主miRNA与病毒相互作用............................................................................131.6.1病毒感染对miRNA表达谱的影响..........................................................141.6.2miRNA对病毒复制的影响........................................................................141.6.3利用miRNA影响病毒嗜性......................................................................161.6.4miRNA与PRRSV.......................................................................................171.7本研究目的和意义...............................................................................................18第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制......................................192.1材料与方法...........................................................................................................192.1.1细胞与病毒..................................................................................................192.1.2miRNA模拟体（mimics）.........................................................................202.1.3主要试剂......................................................................................................212.1.4主要仪器......................................................................................................212.1.5miRNAmimics转染和病毒多步生长曲线................................................212.1.6间接免疫荧光试验（IFA）.......................................................................22V 2.1.7SDS-PAGE和WesternBlotting..................................................................222.1.8RNA分离提取和实时定量PCR（qRT-PCR）.........................................222.1.9荧光素酶报告质粒的构建及荧光素酶试验..............................................262.1.10统计学分析...............................................................................................312.2结果.......................................................................................................................312.2.1miR-26a具有抗PRRSV作用....................................................................312.2.2miR-26a对不同基因型和不同毒力的PRRSV毒株均有抑制作用........332.2.3miR-26a对PRRSV的抑制作用与剂量相关............................................342.2.4miR-26家族在PAM细胞上抑制PRRSV复制........................................352.2.5种子区序列对于miR-26发挥抗PRRSV作用是必需的........................362.2.6PAM细胞感染PRRSV引起miR-26a/b上调...........................................372.2.7miR-26a不与PRRSV基因组直接结合....................................................372.2.8miR-26a上调I型干扰素及干扰素刺激基因的表达................................372.3讨论.......................................................................................................................39第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究........................................................413.1材料与方法...........................................................................................................413.1.1细胞、病毒和质粒......................................................................................413.1.2试剂和仪器..................................................................................................413.1.3miRNA的合成............................................................................................423.1.4miRNA转染和病毒多步生长曲线............................................................423.1.5间接免疫荧光试验（IFA）.......................................................................423.1.6SDS-PAGE和WesternBlotting..................................................................423.1.7RNA分离提取和实时定量PCR（qRT-PCR）.........................................433.1.8Taqman探针一步法荧光定量RT-PCR......................................................433.1.9miR-130靶位点的验证...............................................................................453.1.10动物体内试验...........................................................................................453.2结果.......................................................................................................................483.2.1软件预测PRRSV5’UTR含有miR-130潜在结合位点..........................48VI 3.2.2miR-130家族均具有抗PRRSV作用........................................................493.2.3miR-130b对PRRSV复制的抑制作用最强..............................................503.2.4miR-130b抑制PRRSVN蛋白表达..........................................................503.2.5miR-130b抑制作用的强弱与剂量相关.....................................................513.2.6miR-130b对不同北美型PRRSV均有抑制作用......................................523.2.7miR-130b直接靶向北美型PRRSV5’UTR..............................................533.2.8miR-130b不激活IFN-α和TNF-α.............................................................543.2.9miR-130b抗PRRSV感染的体内试验......................................................553.3讨论.......................................................................................................................57第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索......................................594.1材料与方法...........................................................................................................594.1.1细胞、质粒与细菌......................................................................................594.1.2主要试剂......................................................................................................594.1.3主要仪器......................................................................................................594.1.4病毒感染和总RNA提取...........................................................................594.1.5小RNA深度测序及数据分析...................................................................604.1.6miRNA选取与引物设计............................................................................604.1.7突变病毒构建.............................................................................................614.1.8突变病毒拯救.............................................................................................634.1.9间接免疫荧光试验（IFA）.......................................................................634.1.10病毒多步生长曲线...................................................................................634.1.11突变病毒传代及测序...............................................................................644.2结果.......................................................................................................................644.2.1深度测序小RNA文库的特征...................................................................644.2.2PRRSV感染前后miRNA表达的差异......................................................654.2.3定位在病毒基因组的vsRNA分布...........................................................664.2.4突变病毒N蛋白检测................................................................................664.2.5突变病毒生长曲线.....................................................................................66VII 4.2.6突变病毒遗传稳定性.................................................................................674.3讨论.......................................................................................................................68第五章全文结论.............................................................................................................69参考文献.............................................................................................................................70VIII 图表目录图1.1PRRS病毒粒子结构示意图（摘自MusicandGagnon等，2010）...................2图1.2PRRSV基因组复制与亚基因组转录模型(摘自FangandSnijder，2010）.....3图1.3PRRSV复制周期中亚基因组转录和蛋白质翻译的策略....................................4图1.4PRRSV感染调控I型干扰素产生（摘自Sun等，2012）.................................7图1.5microRNAs的生物学发生（摘自Swaminathan等，2013）..............................8图1.6miRNA调控的高效性模式图（摘自Zhuo等，2013）......................................9图1.7miRNA结合位点的类型（摘自Bartel等，2009）...........................................10图1.8细胞miRNA影响病毒复制的示意图（摘自GottweinandCullen，2008）..15图1.9利用内源miRNA调控病毒复制示意图（摘自Swaminathan等，2013）.....17图2.1pGL3-Control荧光素酶报告载体质粒图谱........................................................26图2.2含有PRRSV基因组cDNA片段的PGL3荧光素酶报告载体的构建图解....28图2.3在15种miRNA中miR-26a被证明可有效抑制PRRSV复制........................32图2.4miR-26a对PRRSV抑制作用比miR-26b更为显著..........................................32图2.5miR-26a抑制PRRSVN蛋白表达.......................................................................33图2.6miR-26a对不同基因型和不同毒力的PRRSV毒株均有抑制作用..................33图2.7miR-26a对PRRSV生长的抑制作用与剂量相关..............................................34图2.8miR-26a对ORF7RNA水平的抑制作用与剂量相关........................................34图2.9miR-26a对PRRSVN蛋白表达的抑制作用呈剂量相关性...............................35图2.10转染miR-26家族后vJX143在PAM细胞上的生长曲线.............................35图2.11种子区序列对于miR-26发挥抗PRRSV作用是必需的................................36图2.12PAM细胞感染PRRSV后miR-26a/b的相对表达量.......................................37图2.13miR-26a不与PRRSV基因组直接结合............................................................38图2.14miR-26a上调I型干扰素及干扰素刺激基因的表达........................................38图3.1一步法荧光定量RT-PCR的标准曲线................................................................44图3.2miR-130结合PRRSV基因组模型及其保守性分析..........................................48图3.3miR-130家族抑制PRRSV基因表达和病毒产出..............................................49图3.4转染miR-130家族后vJX143在PAM细胞上的生长曲线..............................50IX 图3.5miR-130b抑制PRRSVN蛋白表达....................................................................51图3.6miR-130b对PRRSV抑制作用的强弱与剂量相关............................................52图3.7miR-26a对多株北美型PRRSV均有抑制作用..................................................53图3.8miR-130b与北美型PRRSV5’UTR直接结合....................................................53图3.9miR-130b不能上调I型干扰素及TNF-α表达...................................................54图3.10动物体内试验体温及存活率统计.....................................................................55图3.11攻毒后21天组织病理变化...............................................................................56图3.12动物体内PRRSV生长曲线..............................................................................57图4.1小RNA文库中鉴定出的miRNA长度分布情况..............................................64图4.2PRRSV感染前后表达差异最明显的miRNA.....................................................65图4.3间接免疫荧光试验检测突变病毒N蛋白的表达..............................................66图4.4突变病毒和亲本病毒在MARC-145细胞上的生长曲线..................................67表1.1常用microRNA相关数据库一览表...................................................................10表1.2miRNA靶基因预测分析软件一览表..................................................................12表1.3细胞miRNA结合病毒RNA直接调控病毒复制..............................................15表1.4细胞miRNA作用于细胞组分间接调控病毒复制............................................16表1.5已报道的影响PRRSV复制的宿主细胞miRNA...............................................18表2.1本章节中所使用的miRNA模拟物和抑制物序列............................................20表2.2实时荧光定量PCR试验中使用的引物序列......................................................25表2.3构建荧光素酶报告质粒所用引物.......................................................................28表3.1本章节中所使用的miRNA模拟体、突变体和抑制物的序列........................42表3.2一步法RT-PCR试验中使用的引物序列............................................................44表3.3动物试验分组和免疫攻毒剂量...........................................................................46表4.1本章节中所使用的miRNA序列及其反向互补序列........................................60表4.2构建含有miRNA结合位点的系列突变体所需引物........................................61表4.3PRRSV感染后MARC-145细胞中最高表达量的miRNA................................65X 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称PRRSVPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus猪繁殖与呼吸综合征病毒NNucleocapsid核衣壳ORFOpenReadingFrame开放阅读框UTRUntranslatedRegion非翻译区FBSFetalBovineSerum胎牛血清BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位MOIMultiplicityofInfection感染复数TCID5050%TissueCultureInfectiveDose半数组织培养感染量hpiHoursPostInfection感染后小时数μLMicroliter微升mLMilliliter毫升μgMicrogram微克hHour小时minMinute分钟secSecond秒rpmRotationPerMinute转/分ntnucleotide,核苷酸bpBasePair碱基对kbKilobase千碱基pHPowerofHydrogen酸碱度DNADeoxyRibonucleotideAcid脱氧核糖核酸RNARibonucleicacid核糖核酸cDNAComplementaryDNA互补DNAPCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应qRT-PCRQuantitativeReal-timePCR实时定量PCRIFAImmunofluorescenceassay免疫荧光试验GAPDHGlyceraldehyde-3-phosphateDehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶PAMPorcineAlveolarMacrophage猪肺泡巨噬细胞IFNInterferon干扰素XI 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论第一章绪论1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒概述猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）作为猪繁殖与呼吸综合征的病原，是一种单股正链有囊膜的RNA病毒，其首次被发现于1987年美国中西部(Albina,1997;Doneetal.,1996)。猪繁殖与呼吸综合征又被称为“蓝耳病”，是一种高度接触性传染病，以母猪繁殖障碍（晚期流产、早产、死胎、弱胎、木乃伊胎）和仔猪呼吸障碍、非特异性淋巴单核性和间质性肺炎甚至死亡等为主要临床表现(Benfieldetal.,1992;Chandetal.,2012;Collinsetal.,1992;Poletal.,1991)。1996年，我国学者郭宝清等首次从京郊猪场PRRSV阳性血清中分离到了该病毒。2006年，我国南方猪场爆发了“高热症”（PorcineHighFeverDisease，PHFD），临床上表现为高热、耳朵发绀、高发病率、快速传播和高死亡率，其病原最后被证实是一种变异的PRRS病毒，而后此病毒被命名为高致病性PRRSV（HighlyPathogenicPRRSV，HP-PRRSV）(Tongetal.,2007;Zhouetal.,2008)。目前，PRRS给我国乃至全世界养猪业造成了巨大的经济损失，与经典PRRSV不同，HP-PRRSV可感染不同年龄、不同阶段、不同性别的猪群，且均可造成发病，并呈现出高致死率(Tianetal.,2007)。由于该病的广泛流行性和严重危害性，故PRRSV在世界范围内均是研究的热点。1.2PRRSV病原学研究进展PRRSV在分类学上隶属于套式病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arterividae）、动脉炎病毒属（Arterivirus），与其同属的还有研究较多的马动脉炎病毒（Equinearteritisvirus，EAV），以及另外两个成员，即猴出血热病毒（Simianhemorrhagicfevervirus，SHFV）和小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒（Lactatedehydrogenase-elevatingvirusofmice，LDV）(Cavanagh,1997;Gonzalezetal.,2003;Gorbalenyaetal.,2006)。根据遗传特性和抗原差异，PRRSV可以分为北美型（2型）和欧洲型（1型），各自的代表毒株是VR-2332(Benfield,etal.,1992)和Lelystad株(Wensvoortetal.,1992)。虽然1型和2型PRRSV几乎同时被发现且引起类似的临床症状，但它们在不同的大陆造成流行，且两型全基因组序列相似性仅有约60%左右(Forsberg,2005;Hanadaetal.,2005)。在电镜下观察可见，成熟的PRRSV病毒粒子具有晶体多态性，呈卵状或螺旋状，大小约50～65nm(Spilmanetal.,2009)，光滑的外表上点缀有少量囊膜蛋白复合体，核心呈中空分层，由N蛋白通过共价或非共价键连接组成的二聚体构成一个螺旋状的核衣壳，中心包裹病毒核酸RNA(Deaetal.,2000;DoanandDokland,2003)。1.2.1PRRSV基因组结构PRRSV基因组全长大约15kb左右，为单股正链RNA，不分节段，其5’端含有帽子（Cap）结构和非编码区（5’UTR），3’端含有非编码区（3’UTR）和poly(A)尾结构(Conzelmannetal.,1993;Meulenbergetal.,1993)。5’UTR被证明含有病毒基因组复制和亚基因组转录所必不可少的顺式作用原件，其末端包含独立且在种间保守的转录调控序列（Transcription-RegulatingSequence，TRS），1 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论在病毒跳跃式转录过程中意义重大(Gaoetal.,2012)。与其它动脉炎病毒属的成员相类似，PRRSV基因组也是多顺反子，基因结构相互重叠，复杂且紧密，包括至少10个开放阅读框（OpenReadingFrame，ORFs），在5’端有两个大的开放阅读框（ORF1a和1b），长度占整个基因组的大约三分之二(Allendeetal.,1999;vanAkenetal.,2006a)。ORF1a和ORF1b之间有16nt重叠，其中含有RNA聚合酶翻译时发生核糖体移码所必须的7nt滑动序列（UUUAAAC）以及位于下游的拟结（pseudoknot）序列。随后利用-1型核糖体移码机制（-1ribosomalframeshifting），在ORF1a翻译终止之前，ORF1b即发生核糖体移码开始翻译，从而得到多聚蛋白前体pp1a和pp1ab(SnijderandMeulenberg,1998)。通过自身酶解作用，pp1a和pp1ab断裂成至少14个非结构蛋白，参与形成多聚复制转录酶复合体（RTC），进而启动病毒基因组复制和亚基因组转录。病毒的结构蛋白由ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7基因来编码，转录形成具有共同的5’端前导序列和一致的3’末端的嵌套式亚基因组mRNA，分别编码形成糖蛋白2a（GP2a）、小囊膜蛋白E（GP2b）、囊膜糖蛋白GP3、GP4、GP5和新发现的ORF5a，以及非糖基化的膜蛋白M（membraneprotein）和核衣壳蛋白N（nucleocapsidprotein）(Faggionietal.,2009;Firthetal.,2011;Johnsonetal.,2011;MusicandGagnon,2010;SnijderandMeulenberg,1998;Wuetal.,2001)。图1.1PRRS病毒粒子结构示意图（摘自MusicandGagnon等，2010）Fig.1.1SchematicrepresentationofthePRRSVparticle(MusicandGagnon,2010).1.2.2PRRSV基因组复制与亚基因组转录与其它动脉炎病毒成员相类似，PRRSV复制周期起始于病毒基因组RNA直接编码相关复制酶的表达，即pp1a和pp1ab。如上文所述，多聚蛋白前体pp1a和pp1ab首先通过自身具有的类木瓜蛋白酶活性和类胰凝乳蛋白酶活性水解断裂为14个非结构蛋白。其中与复制转录相关的酶协同其它病毒蛋白以及某些参与PRRSV复制的细胞蛋白被共同装配入复制转录酶复合体（RTC）中。RTC具有RNA聚合酶活性，借助细胞核糖体，以PRRSV基因组为模板，沿3’到5’方向复制产生与基因组RNA完全互补配对的负链基因组RNA(MusicandGagnon,2010)。在与PPRSV同2 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论属的病毒EAV中研究发现，在紧靠其3’poly(A)尾上游有一段保守短序列，对启动负链基因组RNA合成有着至关重要的作用。负链基因组RNA从复制中间体解离后，可作为模板，合成出与病毒基因组序列一致的正链基因组RNA，即为子代病毒基因组。然而，RdRp的互作结构域和其在RTC中转录复制的具体机制依然未完全清楚（如图1.2A）(FangandSnijder,2010)。在转录方面，套式病毒目的成员们有着不同于其它单链正股RNA病毒的独特之处，即采用非连续性转录（DiscontinuousTranscription）方式，PRRSV亦是如此。首先，合成一系列具有相同的3’末端“mRNAbodies”，称为编码体，而后通过LeaderTRS（TranscriptionRegulatingSequence）与BodyTRS相互作用，完成不连续性跳跃，以正链基因组RNA为模板，合成出一系列负链sgmRNAs，再以负链sgmRNAs为模板转录出正链sgmRNAs（如图1.2B），每条sgmRNA的5’端都共有一段“前导序列（LeaderSequence）”，进而翻译出PRRSV结构蛋白。最后，复制产生的子代病毒基因组与翻译产生的PRRSV结构蛋白进行装配和释放，得到具有感染活性的子代病毒（如图1.3）(Faabergetal.,1998;FangandSnijder,2010;MusicandGagnon,2010;Pasternaketal.,2006;SawickiandSawicki,1995)。图1.2PRRSV基因组复制与非连续亚基因组RNA转录模型(摘自FangandSnijder，2010）Fig.1.2ThemodelsforreplicationandtranscripitoninPRRSV(FangandSnijder,2010).1.2.3PRRSV非结构蛋白与结构蛋白1.2.3.1非结构蛋白究竟PRRSV可以编码几个非结构蛋白，它们的功能又是什么，至今仍是我们不能完全解答的问题。新的非结构蛋白仍有发现，而在功能方面，我们一般认为PRRSV非结构蛋白具有蛋白3 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论酶、复制酶和聚合酶活性，主要参与病毒RNA合成、调控病毒对宿主的免疫逃避反应以及抑制干扰素表达等(MusicandGagnon,2010)。图1.3PRRSV复制周期中亚基因组转录和蛋白质翻译的策略Fig.1.3OverviewofthePRRSVreplicativecyclehighlightingthevariousstepsinviralRNAandproteinsynthesis.如前所述，pp1a经自身酶解后形成9个非结构蛋白，即nsp1α、nsp1β和nsp2-8。nsp1由三个功能域组成，即nsp1α、nsp1β、锌指(FangandSnijder,2010;SnijderandMeulenberg,1998;Ziebuhretal.,2000)。它是一种多功能蛋白，对PRRSV复制和sgmRNA转录至关重要(Kroeseetal.,2008)，还可抑制干扰素和肿瘤坏死因子TNF-α的产生，进而破坏宿主先天性免疫反应。nsp1α可抑制NF-κB的核内转运和IFN-β的产生(Sunetal.,2009;Xueetal.,2010)；而nsp1β则可能通过抑制激活分子对IFN的诱导或是通过阻断STAT1/STAT2核转运，进而抑制I型IFN通路中信号分子的产生及信号转导(Ait-Alietal.,2011;Beuraetal.,2010;Pateletal.,2010;Subramaniametal.,2010)。另外，还有研究显示nsp1α/β与病毒毒力也密切相关(Chenetal.,2010)。nsp2是PRRSV最大的非结构蛋白，大约为980个氨基酸，同时是变异最大的区域，故常用于检测病毒变异(Hanetal.,2007;Tian,etal.,2007)。它可耐受碱基缺失和插入，故也常作为流行病学调查和疾病诊断分子的标记(Xuetal.,2012)。最近研究发现，nsp2可通过-2移码机制生成新的蛋白nsp2TF(Fangetal.,2012)。Nsp4具有丝氨酸蛋白酶活性，含有一个3C样丝氨酸蛋白酶3CLSP，参与pp1ab的水解此外它还具有IFN抑制作用(Beura,etal.,2010;vanAken,etal.,2006a;vanAkenetal.,2006b)。pp1ab经切割形成4个非结构蛋白（nsp9、nsp10、nsp11、nsp12），其中含有复制酶、锌指结4 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论构和解螺旋酶等结构域(vanAken,etal.,2006a)。Nsp9经推测具有RdRp活性，组成PRRSV复制酶体。Nsp10则具有解旋酶活性和ATP酶活性(MusicandGagnon,2010)。Nsp11在所有套式病毒之中非常保守，具有核糖核酸内切酶活性，同时也可抑制IFN产生(Beura,etal.,2010;Posthumaetal.,2006;Shietal.,2011)。1.2.3.2结构蛋白研究表明，PRRSV结构蛋白包括囊膜糖蛋白GP2a、GP3、GP4、GP5，分别由ORF2a、ORF3、ORF4和ORF5编码；非糖基化囊膜E、膜基质蛋白M和核衣壳蛋白N，分别由ORF2b、ORF6和ORF7编码(Conzelmann,etal.,1993)；新发现的ORF5a蛋白，由位于ORF5内部的ORF5a编码(Johnson,etal.,2011)。GP5和M是病毒粒子的主要组分，称为主要囊膜蛋白（majorenvelopedprotein）；相对地，GP2a、GP3、GP4和E在病毒粒子表面的含量较少，则称为次要囊膜蛋白（minorenvelopedprotein）(SnijderandMeulenberg,1998)。前三者可能经二硫键连接形成异源三聚体，并与E蛋白相互作用，对PRRSV感染性至关重要(Wieringaetal.,2003;Wissinketal.,2005)。将EAV的次要囊膜蛋白与PRRSV替换，可以改变病毒嗜性(Tianetal.,2012)。新发现的ORF5a位于GP5蛋白N端编码区内部(Firth,etal.,2011)。GP5蛋白是含量最丰富的糖蛋白，包含多个中和表位，可产生较强的保护性中和抗体，参与病毒感染与免疫。M蛋白保守性高，免疫原性强，可与GP5形成异源二聚体，参与PRRSV的吸附与组装(Fangetal.,2006;Wissink,etal.,2005)。N蛋白由ORF7基因编码，在成熟病毒粒子中含量最高，是病毒核衣壳中唯一的蛋白成分，负责包裹核酸RNA，另外它可以进入细胞核，这可能与病毒在体内的致病性和免疫应答有关(Dea,etal.,2000;Peietal.,2008)。1.2.4PRRSV细胞嗜性与入侵无论体内感染还是体外培养环境中，PRRSV可感染的细胞谱都非常窄，说明其具有严格的细胞嗜性。在体内环境下，PRRSV主要感染已经分化完全的单核巨噬细胞，尤其是其首要靶细胞——猪肺泡巨噬细胞（PAM）(Duanetal.,1997)。而在其它组织中，包括有淋巴结、心脏、胸腺、脾和肾上腺等，PRRSV可以感染间质性巨噬细胞(Beyeretal.,2000;Halburetal.,1995)。研究者还通过原位杂交和免疫组化鉴定发现，在猪心脏内皮细胞、睾丸中的精细胞、脾脏树突状细胞和胸腺的间质细胞中，也可以检测到病毒RNA和N蛋白(Suretal.,1997)。PRRSV最初是从原代培养的PAM细胞中被分离得到(Wensvoortetal.,1991)。至今为止，只有PAM细胞和猪血液单核细胞，可以作为PRRSV有效复制的猪体细胞。在传代细胞系方面，来源于非洲绿猴肾细胞MA104的亚细胞系MARC-145细胞，可使得PRRSV各个毒株在体外有效地复制(Kimetal.,1993)。研究者通过流式细胞技术和荧光抗体试验，分析了MARC-145细胞中PRRSV抗原的表达情况。试验结果显示，感染初期PRRSV抗原在MARC-145细胞中随机少量表达，感染后2-3天（对数期），PRRSV抗原则成簇表达，且这种现象发生在细胞病变（CPE）之前。研究证明，秋水仙素和细胞松弛素D在PRRSV感染早期和对数期均可抑制病毒复制，说明在病毒入侵细胞和在细胞间转移方面，细胞骨架作用巨大(Cafrunyetal.,2006)。在PRRSV如何入侵细胞方面，Kreutz和Ackermann首次报道并推测PRRSV进入细胞极有5 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论可能是通过受体介导的内吞作用完成的(KreutzandAckermann,1996)。目前，已证实的PRRSV受体包括与PRRSV结合有关的硫酸肝素，参与结合、内吞作用的唾液酸粘附素和波形蛋白等。硫酸乙酰肝素作为PRRSV进入PAM细胞的最初结合位点，由病毒M/GP5蛋白复合物介导其发挥作用(Delputteetal.,2002)。唾液酸粘附素（PoSn）则是内化受体，存在于特定组织（肺、淋巴结、肝、脾、骨髓等）的亚型巨噬细胞中，但不包括腹膜巨噬细胞和单核细胞(Vanderheijdenetal.,2003)。PoSn与M/GP5蛋白复合物相互作用，进而促进病毒粒子的吸附和内吞作用(Delputteetal.,2005;Delputteetal.,2007)。同时，CD163分子与囊膜蛋白GP2a以及GP4相互作用，参与PRRSV脱壳作用(VanGorpetal.,2008)。1.3PRRSV持续性感染与先天性免疫先天性免疫，尤其是I型干扰素（IFN-α/β）的信号传导，是宿主细胞对抗病毒感染的第一道防线，反过来，病毒则不断致力于逃避宿主的免疫监视。作为斗争的结果，病毒就可能持续存在于宿主体内，并逐渐发展成慢性感染。持续性感染可能是由于机体中和抗体产生的延迟和先天性免疫反应的抑制导致。当PRRSV入侵后，处于急性感染期3至4周，之后将维持一段隐蔽性感染期，期间病毒保持低水平持续复制，且机体并未出现病毒血症，病毒仅在扁桃体、淋巴结以及其它免疫器官中复制(Beyer,etal.,2000;Rowlandetal.,2003)。一般地，病原进入细胞后，首先由模式识别受体（pattern-recognitionreceptors，PRRs）识别异己的病原相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpattern，PAMP），促发信号级联反应，诱发炎性因子的表达，进一步清除病原，抵抗感染(Kumaretal.,2011)。IFNs是PRRs下游的重要效应分子，在先天性免疫抗病毒防御和活化获得性免疫方面发挥重要作用(LeBonandTough,2002;SadlerandWilliams,2008;Welshetal.,2012)。RIG-I/MDA5和JAK-STAT是IFN产生的两个主要信号通路。然而，PRRSV可通过多种策略操纵TLR和RIG-I介导的干扰素产生和JAK-STAT信号通路(Sunetal.,2012)。研究发现，PRRSV不能显著提升任何促炎症因子的表达，尤其是I型干扰素、IL-1和TNF-α，但可以显著上调表达IL-10，进而降低炎性细胞因子数量及Th1型免疫应答水平(Buddaertetal.,1998;Thanawongnuwechetal.,2004;Thanawongnuwechetal.,2001;VanReethetal.,1999)。PAM细胞在体内外均是PRRSV复制最活跃的部位，但随着病毒RNA大量产生，却仅能检测到低水平的IFN-α(Milleretal.,2009)。经UV灭活后，PRRSV抑制IFN-α的作用也随之消失(Albinaetal.,1998)。目前已知PRRSV至少有4种非结构蛋白（Nsp1、Nsp2、Nsp4、Nsp11）与此有关。Nsp1对IFN-β启动子的活性呈现抑制，Nsp1β和Nsp11则通过抑制IRF-3调控IFN的产生(Kimetal.,2010)。Nsp2可以抑制IRF-3的磷酸化入核，同时在NF-κB和ISGs通路中具有解离作用(Lietal.,2010)。Nsp11蛋白具有内切核糖核酸酶活性，可以下调IRF-3和NF-κB信号通路(Nedialkovaetal.,2009)。PRRSV也能够抑制干扰素刺激因子（ISGs）的分泌。用IFN-α处理MARC-145细胞后24h，JAK-STAT通路被抑制，ISG15和ISG56mRNA水平明显下调，ISGF3的核移位也被阻断（图1.4）(Patel,etal.,2010)。ISG15作为一种泛素样分子，可与蛋白可逆性结合，进而调控先天性免疫反应。Nsp2的OUT区域则有去泛素化活性，可以减少泛素化和ISG化，进而协助PRRSV逃避先天性免疫反应(Sun,etal.,2012)。6 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论另一方面，PRRSV感染促进NF-κB和AP-1通路活化，但抑制IRF-3活性(Luoetal.,2008)。与许多其它病毒感染抑制NF-κB活化来逃避先天性免疫不同，PRRSV能在MARC-145细胞上迅速活化NF-κB，在PAM细胞上则晚期活化NF-κB，调控宿主细胞的增殖和凋亡，利于自身的复制；但阻止NF-κB活化也不会影响PRRSV复制(LeeandKleiboeker,2005;Luo,etal.,2008)。N蛋白第30-73位氨基酸被证明，既是N蛋白同源二聚体形成，也是NF-κB活化所必需的，还包含核内及核仁定位信号，这暗示N-N二聚体可能与NF-κB活化有关。相反地，Nsp1α被证明可以抑制NF-κB活化(Songetal.,2010a)；Nsp2则通过干扰磷酸化IκB的聚泛素化，抑制IκB降解，进而下调NF-κB(Li,etal.,2010)。目前针对PRRSV介导的先天性免疫研究主要是在MARC-145细胞或是PRRSV非允许细胞（如HeLa细胞）上进行。在天然靶细胞PAM和自然宿主动物猪体内虽然也有一些有限的研究，但提升与自然感染的相关性，仍是未来研究的重点。综上所述，PRRSV感染早期Nsp1、Nsp2、Nsp2、Nsp4和Nsp11参与抑制I型IFN产生及其下游通路的活化，进而促进病毒RNA复制和翻译；感染晚期，则通过调节NF-κB通路活化，营造出利于自身在细胞中生存的环境。图1.4PRRSV感染调控I型干扰素产生（摘自Sun等，2012）Fig.1.4ThemodulationoftypeIIFNproductionbyPRRSV(Sun,etal.,2012).7 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论1.4MicroRNA研究概述1.4.1MicroRNA的发现与定义大约二十年前，有两篇极具开创性的研究论文报道，在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）体内发现一种长度为21nt的小RNA分子，可以通过转录后水平调控lin-14基因的表达进而控制幼虫的发育。有趣的是，这个小RNA分子（称为lin-4）的序列与lin-14基因3’非翻译区的部分序列完全互补(Leeetal.,1993;Wightmanetal.,1993)。然而，这项在无脊椎动物的发现并没有引发科学界的热情。直到2001年，三项独立的研究发现在果蝇和人类体内，都存在着一类内源的小RNA调控分子，并提供了它们的表达模式和进化保守性方面的证据(Lagos-Quintanaetal.,2001;Reinhartetal.,2000)。至此，一类新的可抑制靶目标mRNA翻译的小分子RNA横空出世，并被命名为microRNA（miRNA或miR）(Griffiths-Jones,2004;Lauetal.,2001)。miRNA是一类真核生物内源性的非编码小RNA，大小约19-24nt，在进化上高度保守，其被认为是通过mRNA转录后水平引发基因沉默或影响细胞特性，而并非用于防御外来核酸(Bartel,2004;ChuangandJones,2007)。研究表明，miRNA通过结合在碱基部分互补的同源序列上，触发目标mRNA降解或翻译抑制，从而降低蛋白质的产量。在线虫、节肢动物和脊索动物中，编码miRNA的基因超过2%，推测可影响宿主超过60%的转录本表达，产生令人难以置信的强大影响(Friedmanetal.,2009)。随着研究深入，miRNA也逐渐展现出在调节宿主-病原体相互作用和先天性免疫方面的重要性(Lodishetal.,2008;Scariaetal.,2007;tenOever,2013)。1.4.2MicroRNA的生物学发生图1.5microRNAs的生物学发生（摘自Swaminathan等，2013）Fig.1.5BiogenesisofmicroRNAs(miRNAs)(Swaminathanetal.,2013).8 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论真核细胞miRNA的生物学加工和成熟过程见图1.5。首先在细胞核内，由独立的转录单元或pre-mRNA内含子编码产生的miRNA初始转录本被RNA聚合酶II切割形成具有―帽子‖结构的初始miRNA（pri-miRNA）；然后，经RNaseIIIDrosha核酸酶的剪切去除帽子末端不互补的部分，形成发夹结构的前体miRNA（pre-miRNA），长度约为65-80nt；最后，在核质转运蛋白Exportin-5的作用下，pre-miRNA被转运到细胞质中，并在RNaseIIIDicer蛋白酶的切割下，产生成熟的单链miRNA，长度约22nt左右。成熟的miRNA被RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）识别，并装配在RISC上，依赖部分碱基互补配对的原则去识别和结合靶基因，微调目的基因的表达(Lundetal.,2004;Schwarzetal.,2003)。miRNA的序列元件常位于目标mRNA的非编码区中，并与miRNA引导链5’端第2-8位碱基完全互补配对，这个区域常被称为miRNA的种子区（SeedRegion）。miRNA种子区以外的碱基常常只是与目标mRNA部分互补配对，这是miRNA–靶基因相互作用的常见特征(Bartel,2009;Shuklaetal.,2011)。1.4.3MicroRNA的作用特征从lin-4首次发现，到目前为止共有28654miRNA（或pri-miRNA）从动物、植物、细菌、病毒被鉴定出来（release21，miRBase）。作为基因表达的重要转录后调节因子，miRNA在控制体内转录物保持相对稳定平衡方面有重大的贡献，对机体正常发育、器官形成、造血、疾病发生、病毒防御、细胞增殖凋亡、脂肪代谢和进化等过程造成了重要的影响(Bartel,2004)。miRNA有以下几个显著的特征：（1）小分子。miRNA在进化上保守，不具有免疫原性，长度在22nt左右，5’端2-8nt为种子区；（2）作用广泛。miRNA在发育、细胞分化、细胞凋亡、先天性免疫和分子代谢中发挥着重要的作用；（3）高效。平均而言，一种miRNA可调节超过100种靶基因，同时大于50%的转录物可由两个以上miRNAs协同调节，形成一个精密复杂的调节网络（见图1.6）；（4）结合位点多样性（见图1.7）。miRNA可特异性结合目标mRNA的3’UTR、5’UTR或编码区，且结合位点具有多种类型；（5）miRNA的生物合成具有共性和个性(Zhuoetal.,2013)。图1.6miRNA调控的高效性模式图（摘自Zhuo等，2013）Fig.1.6PossiblehighlyefficientregulationmodesofmiRNAs(Zhuo,etal.,2013).9 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论图1.7miRNA结合位点的类型（摘自Bartel等，2009）Fig.1.7TypesofmiRNAtargetsites(Bartel,2009).随着分子生物学技术和生物信息学软件的发展，越来越多miRNA被鉴定出来，并对其功能和特征进行分析和验证。更重要的是，SmallRNA深度测序技术可在一个反应中完成几千甚至百万物种RNA片段的序列分析，极大地推进了miRNA的研究进程(Jagadeeswaranetal.,2010)。目前，miRNA功能研究的方法主要是通过抑制或过表达。相关数据库（见表1.1）和软件（见表1.2）的不断发展，也为鉴定和预测miRNA及其靶基因提供了强有力的支持。表1.1常用microRNA相关数据库一览表Table1.1SummaryofdatabasesformicroRNAs.名称内容参考文献网址最主要的miRNA公共数据库之一，miRBase存储已发表的序列数据、注释及预测(Griffiths-Jonesetal.,2008)http://www.mirbase.org基因靶标等全方位信息动物miRNA靶向互作数据库，人工http://mirecords.bioleadmiRecords(Xiaoetal.,2009)收集预测的和已验证的靶标.org/植物miRNA数据库，包括靶基因、(Cuietal.,2012;Zhangetal.,http://BioInformatics.caPMRD2010)二级结构、表达谱和基因组搜索u.edu.cn/PMRD/一个关于miRNA靶基因以及代谢通http://lgmb.fmrp.usp.br/miRNApath(Chiromatzoetal.,2007)路的的数据库mirnapath/tools.php10 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论表1.1（续表）名称内容参考文献网址搜集预测的和已知的miRNA染色体CoGeMiR定位、保守性和表达谱方面的信息，(Masellietal.,2008)http://cogemir.tigem.it/总结在不同动物中进化的保守性综合性数据库，提供来自人类、小鼠http://www.ma.uni-heidmiRWalk和大鼠的miRNA的预测信息和经过(Dweepetal.,2014)elberg.de/apps/zmf/mir验证的位于其靶基因上的结合位点walk/全面搜集已验证过的人、小鼠、果蝇、http://diana.cslab.ece.ntTarBase蠕虫和斑马鱼miRNA靶基因，并区(Vlachosetal.,2015)ua.gr/tarbase/分出这些靶基因正确与否一个整合型数据库，包括动物miRNA和基因组元件之间的位置关系以及通http://www.diana.pcbi.umiRGen(Alexiouetal.,2010)过结合其他广泛使用的靶基因预测程penn.edu/miRGen.html序得到动物miRNA靶基因搜集来自miRBase、ICTV、VirGne、VBRC等数据库的病毒数据，包括已http://vita.mbc.nctu.edu.ViTa(Hsuetal.,2007)知miRNA以及相应的由miRanda和tw/TargetScan预测的宿主miRNA靶基因http://alk.ibms.sinica.ed提供已预测的病毒miRNA候选发夹Vir-Mi(Lietal.,2008)u.tw/cgi-bin/miRNA/mi结构序列的数据库RNA.cgi关于转录因子miRNA调节的数据库，http://cmbi.bjmu.edu.cnTransmiR(Wangetal.,2010a)对于用于学术研究是免费的/transmir搜集了多个物种经过验证的miRNAhttp://mirnamap.mbc.ncmiRNAMap及其靶基因，包括人类、小鼠、大鼠(Hsuetal.,2008)tu.edu.tw/和其他多细胞动物microRNA基因表达在线资源库，搜集、整理和分析已发表的miRNA基http://miracle.igib.res.inmiRex(Bielewiczetal.,2012)因表达的数据，通过数千数据点来分/mirex/析基因表达并提供基因表达数据保存一个结合表达谱分析及靶基因预测引http://genome.ewha.ac.kmiRGator导对miRNA进行生物学功能推测阐(Choetal.,2013)r/miRGator/miRGator.h释的数据库tml11 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论1.5MicroRNA识别及靶基因预测上文提到，miRNA可特异性结合目标mRNA的3’UTR、5’UTR或编码区，且结合位点类型多样（图1.7）。识别发生的最主要条件是miRNA5’端2-8位核苷酸（种子区）与靶mRNA序列完全互补配对(Lewisetal.,2003)。为显著降低预测的假阳性，还应利用全基因组比对找出所有与预测出的靶基因结合区域同源的序列，二是鉴定这些同源序列中，与miRNA互补的序列是否保守存在。在下一步进行预测时，我们还需要综合考虑几个非常重要的因素，包括侧翼序列的核苷酸组成(Nielsenetal.,2007)、结合位点的热力学稳定性(Rehmsmeieretal.,2004)、结合位点（特别是种子区）的进化保守性(Friedman,etal.,2009)、二级结构的可访问性(Kerteszetal.,2007)和宿主基因的表达谱(Radfaretal.,2011)。一般情况下，不同预测软件所采用的算法略有不同，所强调的重点也有差异。因此，在进行miRNA预测时，研究者常常会得出不同的预测结果。为了获得更加可信的阳性靶标，我们常常需要交叉检查多种软件和多个算法。目前流行且被大多研究者所使用的miRNA靶基因预测和分析软件有很多种，我们在此做一个汇总，并将软件名称、适用范围及特点、参考文献和网址均列于表1.2，以便于未来试验中查找、比较、设计和使用。表1.2miRNA靶基因预测分析软件一览表Table1.2SummaryofpredictiontechniquesformiRNAtargetrecognitionandanalysis.名称适用范围及特点参考文献网址首先开发的靶基因预测软件，适用范围广泛，不受物种限制，提供多平台版本，可下载到本地；以碱基互补构建打分矩阵，允许G=Uhttp://www.microrna.miRanda(Beteletal.,2008)错配，强调2-4位精确互补，3-12位不得多org/microrna/home.do于5个错配，9至L-5位至少一个错配，最后5位错配不得多于两个通过搜索与每条miRNA种子区域匹配的保(Lewisetal.,2005;Lewis,http://www.targetscan.TargetScan(S)etal.,2003)守8mer和7mer位点来预测靶基因org基于miRNA和靶基因二聚体结构开发的靶http://bibiserv.techfak.基因预测软件；其算法禁止分子内、分子间(KrugerandRehmsmeier,RNA-hybrid2006)uni-bielefeld.de/rnahy及靶基因间形成二聚体，根据自由能探测最brid佳靶位点鉴定miRNA靶标，可提供多个物种非保守但(ChenandRajewsky,2006;http://pictar.mdc-berliPicTarKreketal.,2005)共表达的靶标预测的详细信息n.dehttp://genie.weizmann基于靶位点的可接性（arget-siteaccessibility）PITA(Kertesz,etal.,2007).ac.il/pubs/mir07/mir0预测miRNA靶标7_data.html12 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论表1.2（续表）名称适用范围及特点参考文献网址分析miRNA与靶基因互补结合机制的隐藏http://www.interagon.TargetBoost(Saetrometal.,2005)规则com/demohttp://www.mirz.unibElMMo根据进化保守性和通路分析推测靶标(Gaidatzisetal.,2007)as.ch/ElMMo2/根据总自由能分析预测靶序列与miRNA配mirWIP(Hammelletal.,2008)http://ambroslab.org对结合的拓扑结构http://www.ebi.ac.uk/microCOSM一款在线预测软件，可提供多物种的miRNA(Griffiths-Jones,etal.,2008)enright-srv/microcosTargets靶标预测m/htdocs/targets/v5/一款靶基因预测软件，通过自由能分析DIANAmiRNA和靶基因间的高亲和力；通过影响(Maragkakisetal.,2009a;http://www.microrna.Maragkakisetal.,2009b)-microT3.0miRNA和靶基因所形成二聚体结构的相关gr/microT蛋白指导miRNA和靶基因的相互作用使用线性Gaussian模型，并提供了含有1935http://www.plosone.orInMiR(Radfar,etal.,2011)条已预测的miRNA靶基因的数据组g鉴定一组已知/预测的miRNA及其靶基因的http://mirtar.mbc.nctu.miRTar(Hsuetal.,2011)生物学功能和调控关系edu.tw/human/从深度测序技术数据中注释和鉴定miRNA、http://deepbase.sysu.edeepBasepiRNA、siRNA基因及长非编码RNA基因及(YangandQu,2012)du.cn/其表达模式http://wmd3.weigelwo用于设计长度为21nt的amiRNA，可以特异WMD3(Carbonelletal.,2014)rld.org./cgi-bin/webap性沉默单个或多个目的基因p.cgi1.6宿主miRNA与病毒相互作用我们都知道，病毒是基因调控的大师，它们利用宿主的生物合成系统，完成从复制、转录到蛋白合成等基本的生物过程。病毒自身的基因组被缩减到了可以成功完成感染步骤所必需的最优化的长度。然而宿主miRNA却凭借着单一的且相对更短的种子区序列，同时兼顾调节数百种mRNA的能力。最近有种假说称，宿主miRNA类似于转录因子，是整个基因网络和通路的调控者。那么，当病毒遇见宿主miRNA，究竟会扮演着什么角色呢？它们相互之间的关系是抑制，是促进，还是利用呢？13 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论1.6.1病毒感染对miRNA表达谱的影响很多研究表明，病毒感染可以改变宿主miRNA的表达谱(Cameronetal.,2008;Tribouletetal.,2007)。一方面，这些变化可能是由于病毒感染激发了宿主细胞先天性免疫应答的某个方面，进而采取了行动以抵抗病毒的复制；另一方面，改变细胞miRNA表达谱可能是病毒针对于某个具体的通路某个特定的miRNA所产生的影响，以便于为自己创造一个更有利的细胞内复制环境(Pedersenetal.,2007)。病毒感染后，细胞中几乎所有正常的生物过程都在一定程度上被影响或直接被病毒据为己用，最终将引发全身性的警告和反应。因而很自然地，细胞基因编码产物（包括miRNA）的表达都会受到影响。但究竟这些变化是由于病毒为利于自身复制所诱发的，还是细胞为抵抗病毒感染所引起的，目前尚不清楚。例如，呼吸道合胞病毒（RSV）感染人支气管上皮细胞后，可引发细胞let-7c、let-7i和miR-30b上调，miR-221下调，通过操控NF-κB通路，抑制病毒基因产物，进而抵抗病毒感染(Bakreetal.,2012;Thornburgetal.,2012)。EB病毒（EBV）是一种γ疱疹病毒，与多种人类癌症相关，如霍金森病、Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌等。EBV在人类B细胞潜伏感染时，诱导宿主miR-155上调1000倍以上，是表达最多的miRNA。最重要的是，miR-155是一种促癌miRNA。实验表明，高表达miR-155的转基因小鼠（约为野生型10倍）可引发B细胞白血病和淋巴瘤，由此可见EBV调控miR-155上调表达与自身引起发病有重要关联(Linnstaedtetal.,2010;Luetal.,2008;O'Connelletal.,2008)。在猪病病毒中，也有病毒感染影响宿主miRNA表达谱的相关报道。伪狂犬病毒（PRV）属于α疱疹病毒，感染猪树突状细胞（DC）后，可以改变DC细胞中几种miRNA的表达，包括miR-27b*、miR-29a和miR-30e-3p(Anselmoetal.,2011)。通过分析这些差异表达miRNA的靶基因发现，它们可能与病毒潜伏感染有重大关系。猪流感病毒H1N1亚型也被证明可以影响细胞miRNA的表达谱(Lovedayetal.,2012)。H1N1病毒体外感染人肺泡基底上皮细胞系（A549细胞）的结果显示，有39种细胞miRNA上调和13种miRNA下调。通过靶基因的分析表明，这些差异表达的miRNA具有多种功能，包括调节免疫系统和细胞增殖。另一项研究发现，猪流感的编码基因中存在36种miRNA可能的结合位点(Heetal.,2009)。在这些位点中，有3种miRNA（即miR-124a、miR-136和miR-145）的靶位点似乎已在进化上保守，这表明这些miRNA与病毒基因的相互作用也在流感病毒引起发病过程中起着重要作用。1.6.2miRNA对病毒复制的影响miRNA介导的基因调控范围在整个哺乳动物系统，因而细胞miRNAs也可以直接或间接地影响病毒复制和发病机制（图1.9）。病毒基因组RNA或mRNA有可能演变为与宿主miRNA相互作用，以促进其生命周期的某些步骤；抑或是，这种相互作用会通过选择压力抑制病毒基因复制，以避免结合丰富的细胞miRNA上；最后，受感染的细胞miRNA表达谱变化可能直接或间接影响病毒在细胞上的复制，因为许多与促进或限制病毒复制和感染有关的通路都受到细胞miRNA的调控。宿主miRNA影响病毒复制的作用方式有两种：一是直接结合在病毒基因组RNA上，另一种是作用于细胞成分间接对病毒复制产生影响。然而，虽然很多研究表明宿主miRNA可以直接靶14 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论向病毒基因组RNA或mRNA，但普遍认为这不可能是宿主专为抗病毒防御进化来的。一是由于miRNA在多物种间具有高度保守性，而病毒的宿主范围却相对非常有限，因此不太可能特定miRNA针对特定病毒发生特异性地进化；二是病毒的生命周期相对于宿主要短很多，它们的聚合酶常常具有较高突变率，其结果是导致病毒进化的速度往往远超过宿主(GottweinandCullen,2008;Swaminathan,etal.,2013;UmbachandCullen,2009)。图1.8细胞miRNA影响病毒复制的示意图（摘自GottweinandCullen，2008）Fig.1.8PotentialEffectofCellularmiRNAsonVirusReplication(GottweinandCullen,2008).在此，我们分别就上述两种方式，总结了一些miRNA影响病毒复制的经典例子，列于表1.3和1.4。表1.3细胞miRNA结合病毒RNA直接调控病毒复制Table1.3CellularmiRNAsthatdirectlybindviralRNAtomodulatevirusreplication.对病毒复病毒名称细胞miRNA名称参考文献制的影响灵长类泡沫病毒1型（PFV-1）miR-32抑制(Lecellieretal.,2005)miR-28、miR-150、miR-223抑制(Huangetal.,2007)艾滋病病毒（HIV-1）miR-29a抑制(Ahluwaliaetal.,2008)(Jopling,2010;Joplingetal.,miR-122促进丙肝病毒（HCV）2005)miR-199a抑制(Murakamietal.,2009)miR-323、miR-491、miR-654抑制(Songetal.,2010b)甲型流感病毒（IAV）let-7c抑制(Maetal.,2012)水泡性口炎病毒（VSV）miR-24、miR-93抑制(Otsukaetal.,2007)(GunasekharanandLaimins,人乳头瘤病毒（HPV）miR-145抑制2013)15 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论表1.4细胞miRNA作用于细胞组分间接调控病毒复制Table1.4CellularmiRNAsthatindirectlyaffectvirusreplicationbyaffectinghostproteins.对病毒复制病毒名称细胞miRNA名称靶基因参考文献的影响(Chiangetal.,2012;SungmiR-198、miR-27b抑制cyclinTandRice,2009)艾滋病病毒（HIV-1）miR-17/92cluster抑制PCAF(Triboulet,etal.,2007)miR-155抑制LEDGF、NUP153(Swaminathanetal.,2012)miR-132促进MeCP2(Chiangetal.,2013)CTCF、EGFR、西尼罗河病毒（WNV）Hs_154促进(Smithetal.,2012)ECOP甲型流感病毒（IAV）miR-34c促进PLK4(Bakreetal.,2013)登革热病毒（DV）miR-146a促进TRAF6(Wuetal.,2013)(BhanjaChowdhuryetal.,丙肝病毒（HCV）miR-130a抑制IFITM12012)单纯疱疹病毒（HSV-1）miR-132促进P300(Lagosetal.,2010)1.6.3利用miRNA影响病毒嗜性在利用小干扰RNA（siRNA）和短干扰RNA（shRNA）进行疾病治疗包括抵抗病毒感染取得一定成功后(Angajietal.,2010;Resnieretal.,2013)，我们开始思考输送miRNA病毒载体，操纵miRNA干扰下游基因表达，进行基因治疗作为一个很有吸引力的研究思路。朝着这个目标，有两种设计策略：一是将miRNA靶位点克隆到病毒基因组中，将病毒复制的限定在特定类型的细胞中，影响病毒的嗜性（图1.10A）；二是设计可编码宿主miRNA的病毒去操控细胞的功能或过程（图1.10B）。宿主miRNA并不都具备抗病毒能力，但如果将与miRNA完全互补的靶标位点插入到病毒中，miRNA则将转化为类似viRNA的功能。虽然内源miRNA拷贝数仍然是一个问题，但如果利用含量丰富的miRNA，那么这种策略就可以被用来完全抑制病毒复制(Barnesetal.,2008)。此外，由于miRNA，类似mRNA都在细胞中表达，有些miRNA具有组织细胞特异性，因而可以设计出在特定细胞被抑制而在其它细胞可以复制的病毒，进而影响病毒的组织细胞嗜性。多项研究已经证明这种方法的可行性。Perez等人最先设计出含有miR-93结合位点的重组流感病毒（IAV），只可以感染小鼠且产生有效的免疫反应，并提出了作为重组疫苗病毒候选株的可行性(Perezetal.,2009)。使用类似策略，IAV和登革热病毒（DV）被设计为包含miR-142（只在造血起源的细胞中表达的特异性miRNA）的结合位点(Langloisetal.,2012;Phametal.,2012)。此外，通过构建含有miR-122靶序列的重组DV，从而限制了其在肝脏中的复制(Leeetal.,2010)。Kelley等在小鼠模型中，利用mir-125识别位点（大脑特异性miRNA）和miR-206（肌肉特异性miRNA）抑制水泡性口炎病毒（VSV）引起脑炎(Kellyetal.,2010)。16 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论图1.9利用内源miRNA调控病毒复制示意图（摘自Swaminathan等，2013）Fig.1.9ManipulationofRNAvirusreplicationwithcelluarmiRNA(Swaminathan,etal.,2013).A:RNAvirustropismcanbegreatlyalteredandviralreplicationcanberestrictedtospecificcelltype(s).B:RNAvirusescanbeengineeredtooverexpressmiRNAs.限制病毒感染的另一个潜在战略则可以利用病毒编码宿主miRNA(tenOever,2013)。尽管RNA病毒是否可天然表达miRNA仍存争议，但可以通过人工设计使RNA病毒表达宿主miRNA。我们可以首先选择一种对细胞的抗病毒机制高度敏感的RNA病毒，比如易受I型干扰素调控的VSV，就可以被设计成编码可以靶向I型干扰素通路负调节因子的miRNA。例如，miR-146a通过靶向IRF-5、STAT-1、TRAF6、IRAK1和IRAK2上调I型干扰素的产生(Houetal.,2009;Tangetal.,2009)；miR-155通过抑制负调节因子SOCS-1促进I型干扰素表达(Wangetal.,2010b)。将重组VSV病毒设计为表达miR-146a和miR-155，则会上调IFN产生，最终导致病毒复制被抑制。总地来说，操纵RNA病毒过表达或抑制miRNA为我们提供了一个令人兴奋的治疗新途径。1.6.4miRNA与PRRSV尽管Lecellier等人在2005年就首次报道了宿主细胞miRNA对病毒复制和感染的影响(Lecellier,etal.,2005)，随后又有更多的例子在其它病毒中被发现，然而关于miRNA是否也可以影响PRRSV病毒复制的问题却一直无人解答。直到2013年，miR-125b被发现可以在MARC-145细胞通过靶向上调κB-Ras2基因来抑制NF-κB通路，进一步造成PRRSV复制被抑制(Wangetal.,2013a)。同时，miR-181家族被证明可以直接靶向PRRSV基因组抑制病毒复制，进一步研究发现CD163分子也是miR-181的靶基因(Gaoetal.,2013;Guoetal.,2013)。最近的研究证明miR-24-3p可以通过靶向血红素加氧酶1（HO-1）17 中国农业科学院博士学位论文第一章绪论进而促进PRRSV复制(Xiaoetal.,2015)。这也是第一例关于miRNA促进PRRSV复制的报道。如表1.4，我们总结了至今为止所有关于miRNA影响PRRSV复制的报道。虽然在细胞miRNA与PRRSV复制之间关系的研究方面，我们已经取得了很多有意义的数据，然而我们相信这只是冰山一角，还有更多miRNA的作用等待我们去发掘和验证。表1.5已报道的影响PRRSV复制的宿主细胞miRNATable1.5SummaryoftheinvolvementofhostmiRNAsinPRRSVreplicationinpreviousstudies.对PRRSV复制名称发现时间参考文献靶基因影响miR-125b抑制2013(Wang,etal.,2013a)κB-Ras2(Gao,etal.,2013;Guo,etal.,PRRSVORF4下游miR-181抑制20132013)CD163Snapin、CSF2、IL17RB、miR-147抑制2013(Jetal.,2013)NIT1、PLA2G6miR-23抑制2014(Zhangetal.,2014b)PRRSVORF3下游miR-505抑制2014(Zhang,etal.,2014b)未验证miR-378抑制2014(Zhang,etal.,2014b)未验证miR-506抑制2014(Wuetal.,2014)CD151miR-24-3p促进2015(Xiao,etal.,2015)HemeOxygenase-1（HO-1）1.7本研究目的和意义随着越来越多的研究表明，miRNA在调节宿主-病原体相互作用和先天性免疫方面具有重要的作用。在抗病毒感染和复制方面，宿主细胞miRNA的作用也不可或缺：一方面，miRNA通过序列完全或部分互补配对的方式，直接结合在病毒的基因组或者mRNA上，降解转录产物或者抑制蛋白表达进而起到基因沉默的作用；另一方面，miRNA也可以间接作用于某个细胞成分，常常可以起到影响细胞内通路和调节先天性免疫应答的功效，从而间接干扰病毒的生命周期。反过来，病毒感染也会对细胞miRNA表达谱造成影响，这些影响可能是病毒感染所激发的宿主细胞基因编码产物（包括miRNA）变化的一部分，也可能是病毒针对某些致病相关的特定miRNA所产生。然而在目前的PRRSV研究中，miRNA与病毒相互作用方面的报道寥寥无几。我们相信，仍有许多有意思的例子等待挖掘。在细胞编码的众多miRNA中，还有哪些可以影响PRRSV复制，其发挥作用的机制又是什么？是否可以将细胞miRNA作为未来抗PRRSV治疗的工具？利用内源丰富的miRNA完全互补的靶标位点来构建突变病毒，是否可以改造病毒生长特性，作为一个抑制病毒复制的可行策略？以上问题就是本论文研究目的所在。通过本课题可以更好地揭示细胞miRNA在抗PRRSV感染和复制中的作用，为抗病毒研究的不断深入提供理论和试验依据。18 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制我们在绪论中谈到，宿主miRNA调控病毒复制的一个机制是间接作用于细胞成分，以形成不利于病毒复制的细胞微环境(Triboulet,etal.,2007)。在前人的研究中，多种miRNA被证明与固有免疫的调节和/或抗病毒的作用息息相关(Banerjeeetal.,2013;FoleyandO'Neill,2012;Huangetal.,2014;J,etal.,2013;Jinetal.,2014;PauleyandChan,2008;Schulteetal.,2013;Selvamanietal.,2014)。我们选取了其中15条在多个物种间序列高度保守的miRNA进行体外合成，旨在揭示其与PRRSV复制的关系。因此，本章节将针对这15条miRNA过表达后是否可以在体外抑制PRRSV复制展开讨论。2.1材料与方法2.1.1细胞与病毒非洲绿猴肾（MARC-145）细胞和幼仓鼠肾（BHK-21）细胞由本实验室保存，生长培养基为10%FBS（Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA）的MEM，维持培养基为2%FBS的MEM(YuanandWei,2008)。PAM细胞取自4周龄PRRSV阴性猪，生长培养基为10%FBS的RPMI1640（Gibco），维持培养基为2%FBS的RPMI1640，其分离方法参照前人文献(Wensvoort,etal.,1991)，并稍加改动，具体如下：1.将4周龄的SPF健康仔猪按规程处死，剖开胸腔并剥离气管和其它组织，将肺脏取出，置于PBS缓冲液中；2.移至细胞间超净工作台中，用PBS缓冲液（含1%双抗）经气管注入肺脏中，轻揉肺组织，反复冲洗后吸出，重复此过程8-10次，直到吸出的液体由浑浊变清澈；3.将收集的灌洗液低温（4°C）水平转子500×g离心10min，弃上清；4.将底部细胞用PBS缓冲液洗一遍，重复上述离心步骤后，完全弃去上清；5.用RPMI-1640生长培养基（含2%双抗）重悬细胞，充分吹散后，进行细胞计数；66.将细胞以5×10/孔的密度铺在6孔板中，轻轻摇匀后，放入CO2培养箱中过夜，次日可更换维持培养基，用于下游试验。基因II型即北美型vAPRRS（GenBank登录号：GQ330474）(YuanandWei,2008)和基因I型即欧洲型vSHE（GenBank登录号：GQ461593）(Tianetal.,2011)由本实验室保存，它们分别拯救自PRRSV感染性克隆pAPRRS和pSHE。vJX143（GenBank登录号：GQ475526）是来自2006年猪“高热病”阳性血清的高致病性PRRSV分离株。vJXM100(GenBank登录号：GQ475526)获得自vJX143毒株在MARC-145细胞传代100次后的细胞适应毒株(Wangetal.,2013b)。pJX143感染性克隆构建自vJX143(Lvetal.,2008)。将以上各病毒以低剂量MOI感染MARC-145细胞，待80%细胞出现CPE时收获上清，并在MARC-145细胞上测定滴度，贮存在-80°C冰箱中备用。病毒滴度用标准TCID50测定试验来确定(ReedandMuench,1938)。19 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制2.1.2miRNA模拟体（mimics）本研究中所使用的miRNAmimics均订购自上海吉玛生物制药技术有限公司，且经过2’-甲氧双链RNA寡核苷酸的修饰，以增强其稳定性，其序列均来自于sangermiRNA数据库。miR-26mimics的序列为：miR-26a（26a），5’-uucaaguaauccaggauaggcu-3’；miR-26b（26b），5’-uucaaguaauucaggauaggu-3’。相关的非种子区突变mimics（26-1A、26-9U和26-1A9U）以及种子区突变mimics（26a-m和26b-m）序列参见表3.1（下划线标示出突变位置）。本研究中所使用的其它miRNAmimics和抑制物（inhibitors）以及阴性对照NCmimics的序列也列于表2.1。表2.1本章节中所使用的miRNA模拟物和抑制物序列Table2.1SequencesofmicroRNA(miRNA)mimicsandinhibitorsusedinthisstudy.NameSequence(5′-3′)miR-21UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAlet-7aUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUlet-7bUGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUmiR-30a-5pUGUAAACAUCCUCGACUGGAAGCUmiR-30a-3pCUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGCmiR-30e-3pCUUUCAGUCGGAUGUUUACAGCmiR-181bAACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGUUmiR-107AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCAmiR-197UUCACCACCUUCUCCACCCAGCmiR-146aUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUUmiR-125a-3pACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCmiR-185UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGAmiR-423-5pUGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUUmiR-371-5pACUCAAACUGUGGGGGCACUmiR-26aUUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCUmiR-26bUUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU26-1AAUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU26-9UUUCAAGUAUUCCAGGAUAGGCU26-1A9UAUCAAGUAUUCCAGGAUAGGCU26a-mUAGUUCUAAUCCAGGAUAGGCU26b-mUAGUUCUAAUUCAGGAUAGGUNCUUCUCCGAACGUGUCACGUTTNCinhibitorCAGUACUUUUGUGUAGUACAAmiR-26ainhibitorAGCCUAUCCUGGAUUACUUGAAmiR-26binhibitorACCUAUCCUGAAUUACUUGAA20 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制2.1.3主要试剂®®细胞总RNA抽提试剂TRIZOL、转染试剂Lipofectamine2000和Opti-MEMI购自Invitrogen®公司；质粒抽提试剂盒QIAprepSpinMiniprepKit和病毒上清RNA抽提试剂盒QIAgenViralRNAMiniKit购自QIAGEN公司；高保真聚合酶pfuUltraII购自Stratagene公司；限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购自NEB（北京）公司；胶纯化回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；TM®TMPrimeScript第一链cDNA合成试剂盒和SYBRPremixExTaq酶购自大连宝生物（TaKaRa）®公司；X-tremeGENEsiRNA转染试剂购自罗氏（Roche）公司；FugeneHD转染试剂和双荧光素酶检测系统购Promega公司；通用型I型干扰素购自PBLInterferonSource公司；N蛋白单克隆抗体为西班牙马里兰Ingenasa公司惠赠。其它在本研究中使用的化学试剂（无水乙醇、氯仿、异丙醇等）均为国药分析纯级产品。2.1.4主要仪器本研究中主要仪器有：Bio-Rad核酸和蛋白电泳系统；凝胶成像分析系统（Gene，USA）；Olympus荧光倒置显微镜；Bio-Rad核酸扩增PCR仪（USA）；NanoDropND-1000浓度分析仪（Thermo）；BSL-2超净工作台；ThermoCO2细胞培养箱。另有DK-8D恒温水浴锅、4°C低温离心机、37°C恒温摇床、Eppendorf微量移液器等。2.1.5miRNAmimics转染和病毒多步生长曲线本研究中，miRNA和NCmimics转染PAM细胞和MARC-145细胞的剂量均为80nM（剂量依赖试验除外），使用的转染试剂为购自罗氏公司的X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent，操作方法如下：61.一般使用6孔板进行试验，将准备好的PAM细胞悬液计数后以每孔3×10细胞均匀地铺在孔中，MARC-145细胞则按照正常传代的比例铺板。2.将铺好细胞的6孔板小心置于5%CO2细胞培养箱中，PAM细胞培养过夜后，MARC-145细胞则是生长至密度约60%时，开始进行转染步骤。®3.取适量1.5mLEP管，每管加入50μLOpti-MEMI和5μLX-tremeGENE试剂，轻微混匀。®4.另取适量1.5mLEP管，每管加入50μLOpti-MEMI和4μLmiRNAmimics，轻微混匀。5.将步骤3中液体加入步骤4中液体，并充分混匀。此步骤须在步骤3和4中液体分别混匀后5min之内进行，切勿长时间停留。6.静置20min。7.将6孔板中的生长培养基弃掉，用PBS洗1次，更换为维持培养基。8.将步骤5中的混合液逐滴加入6孔板中，置于5%CO2细胞培养箱中继续培养。9.转染后24h，弃去上清，对细胞进行计数，并按照后续试验要求以合适的MOI感染PRRSV。为分析不同处理组PRRSV生长情况的差异，在感染病毒后每隔12h收集上清0.2mL/孔，存于-80°C冰箱。根据Reed-Muench方法，测定所收集病毒上清的滴度，计算TCID50并绘制病毒生长曲线(ReedandMuench,1938)。21 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制2.1.6间接免疫荧光试验（IFA）间接免疫荧光试验按照前人(Tian,etal.,2011)报道的操作步骤并稍加改动进行，其目的是用于检测MARC-145细胞和PAM细胞转染miR-26家族及其突变体后PRRSVN蛋白表达情况的不同。下面简述其操作步骤：首先以冰甲醇固定细胞20min，PBS清洗3遍后，以1%BSA封闭30min。PBS清洗3遍后，以PRRSV北美型特异性抗体SR30A（RuralTechnologies）1:10000稀释作为一抗孵育2h。PBS清洗5遍后，以AlexaFluor568荧光标记的山羊抗鼠IgG（H+L）（Invitrogen）1:800稀释后作为二抗孵育1h。PBS清洗3遍后，用1g/mLDAPI孵育5min。最后用PBS清洗3遍，将细胞板置于Olympus倒置荧光显微镜下进行观察并拍照记录。2.1.7SDS-PAGE和WesternBlotting转染miR-26a或NCmimics后24h，再以MOI=0.01感染PRRSV48h。用含有1mMN-ethylmaleimide（NEM）的裂解缓冲液冰上裂解MARC-145细胞10min，期间用微量移液器反复吹打。再用细胞刮将裂解产物完全刮下，以12,000×g速度4°C离心15min，收集上清。加入适量含有50mMTris、10%甘油、2%SDS、0.02%（wt./vol.）溴酚蓝和100mMDTT的蛋白上样缓冲液（pH=6.8），置于沸水浴中10min，然后用15%SDS–PAGE蛋白胶进行分离，并将蛋白转移到Hybond-P膜（AmershamBiosciences）上。先经含有5%脱脂乳的TBST溶液（100mMNaCl、10mMTris、0.1%Tween20、pH=7.6）4°C封闭过夜，然后加入特异性PRRSVN蛋白抗体室温孵育3h。TBST洗去一抗后，以HRP标记的山羊抗鼠二抗（SantaCruz）室温孵育1h。经TBST溶液洗膜3次（10min/次），最后用SuperSignalWestPico化学发光试剂盒（ThermoFisherScientific）检测PRRSVN蛋白特异性条带。2.1.8RNA分离提取和实时定量PCR（qRT-PCR）2.1.8.1细胞总RNA的分离提取及反转录®PAM细胞和MARC-145细胞总RNA的分离提取使用TRIZOL法，具体操作步骤按照说明书进行，简述如下：®1.向六孔板加入TRIZOL试剂1mL/孔，用移液器反复吹吸几次，转移到Ep管中；2.加入氯仿200μL，涡旋振荡15s，在常温下静置5min，全速低温（4°C）离心15min；3.离心后呈三层，下层红色部分为有机相，中层白色部分为蛋白，上层透明部分为水相，将上层水相转移到无RNA酶的新Ep管中，注意不要吸到中间红色部分；4.加入异丙醇600μL，颠倒混匀15s，在常温下静置15min，全速低温（4°C）离心15min；5.弃上清，可见有管底白色不透明的絮状沉淀。用75%乙醇1ml洗涤沉淀，上下颠倒混匀，8,000rpm低温（4°C）离心5min；6.弃上清，加入无水乙醇1ml，上下颠倒混匀，8,000rpm低温（4°C）离心5min；7.弃上清，室温静置晾干RNA，至白色沉淀逐渐变得透明时，加入RNAase-free水30μL，放于55°C水浴10min，使RNA完全溶解，-80°C保存。使用Nanodrop浓度分析仪对提取的总RNA进行定量，每个样本取1μg，使用购自大连宝生22 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制TM物公司的PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒在PCR仪上进行反转录，具体方法步骤如下：1.取适量Microtube，按照下述体系配置混合液：TotalRNA1.0μgOligodTPrimers(50μM)1.0μLdNTPMixture(10mMeach)1.0μLRNasefreedH2Oupto10μL2.在PCR仪上进行下述变性、退火反应65°C5min↓冰上急冷3.按照以下体系，在上述Microtube中配置反转录反应液：上述变性、退火后反应液10μL®5×PrimeScriptBuffer4.0μLRNaseInhibitor(40U/μL)0.5μL®PrimeScriptRNase(200U/μL)1.0μLRNasefreedH2O4.5μLTotal20μL4.在PCR仪上开始反转录步骤：30°C10min↓42°C60min↓70°C15min酶失活处理后，冰上放置。5.将制备好的cDNA冻于-20°C备用。2.1.8.2细胞miRNA的分离提取及反转录PAM细胞miRNA分离方法同2.1.8.1。为检测miRNA内源含量，使用购自天根生物miRcutemiRNA第一链cDNA合成试剂盒进行加poly(A)尾和反转录。2.1.8.2.1miRNA3’末端加poly(A)尾1.冰上预冷RNaseFreeEP管，按照下述体系配置反应液：TotalRNA1.0μgE.colipoly(A)polymerase0.4μL10×E.colipoly(A)polymerasebuffer2.0μL5×rATPsolution4.0μLRNasefreedH2Oupto20μL2.轻轻吹打混匀，放在37°C水浴锅中反应60min。23 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制2.1.8.2.2poly(A)尾修饰的miRNA反转录1.冰上预冷RNaseFreeEP管，配置反应液：poly(A)反应液2.0μL10×RTPrimer(10μM)2.0μL10×RTBuffer2.0μLSuperPuredNTP(2.5mM)1.0μLRNasin(40U/μL)1.0μLQuantRNase0.5μLRNasefreedH2O11.5μLTotalVolume20μL2.轻匀反应液，短暂离心后置于37°C水浴中反转录60min。3.将制备好的miRNA第一链cDNA冻于-20°C备用。2.1.8.3实时定量PCR检测2.1.8.3.1ORF7RNA和IFN-α/β、MX1、ISG15mRNA的qPCR检测将2.1.8.1中制备好的cDNA室温融化，利用Step-onePlusreal-timePCRsystem(Applied®TMBiosystems)和SYBRPremixExTaq(Takara)进行qPCR反应。本试验中所使用的引物序列见下表2.2。下面以检测ORF7RNA水平为例，说明该试验进行步骤：1.取ABI96孔微量反应板，避光条件下配置下述反应液：®2×SYBRPremixExTaq12.5μLORF7-F(10μM)1.0μLORF7-R(10μM)1.0μLROXReferenceDye0.4μLRNasefreedH2O8.1μLcDNA2.0μLTotalVolume25μL2.将微量反应板放入qPCR仪，按照下述程序反应：95°C30sec95°C5sec40cycles60°C30secDissociationStage（95°C15sec，60°C1min，95°C15sec）3.利用ΔΔCt法(Bookoutetal.,2006)，计算ORF7RNA相对表达量。PAM细胞试验以GAPDHmRNA水平为内参，MARC-145细胞试验以β-actinmRNA水平为内参，所有引物序列均列于表2.2。24 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制表2.2实时荧光定量PCR试验中使用的引物序列Table2.2SequenceofoligonucleotideprimersusedinqRT-PCR.PrimerSequence(5′-3′)ORF7-FCCCTAGTGAGCGGCAATTGTORF7-RTCCAGCGCCCTGATTGAAmBeta-actin-FTCATCACCATTGGCAATGAGmBeta-actin-RAGCACTGTGTTGGCGTACAGmIFN-α-FGCAGCATCTGCAACATCTACmIFN-α-RGGATCATCTCATGGAGGACAGmISG15-FCACCGTGTTCATGAATCTGCmISG15-RCTTTATTTCCGGCCCTTGATIFN-α-FAGCACTGGCTGGAATGAAACCGIFN-α-RCTCCAGGTCATCCATCTGCCCAIFN-β-FCTGCTGCCTGGAATGAGAGCCIFN-β-RTGACACAGGCTTCCAGGTCCCGAPDH-FCCTTCCGTGTCCCTACTGCCAACGAPDH-RGACGCCTGCTTCACCACCTTCTMX1-FCACAGAACTGCCAAGTCCAAMX1-RGCAGTACACGATCTGCTCCAISG15-FGGTGCAAAGCTTCAGAGACCISG15-RGTCAGCCAGACCTCATAGGC2.1.8.3.2miRNA的qPCR检测将3.1.8.2中制备好的miRNA第一链cDNA室温融化，利用Step-onePlusreal-timePCRsystem（AppliedBiosystems）和miRcutemiRNAqPCR检测试剂盒（天根）进行qPCR反应。本试验中所使用的miRNA上游引物同样购自天根，并以通用表达的RNAU6作为内参，具体操作步骤如下：1.室温融化Premix和ReversePrimer。2.将Premix上下颠倒，轻轻混匀，短暂离心。3.在冰上配置以下体系：2×miRcutemiRNAPremix(SYBR,ROXPlus）10μLmiRNA上游引物0.4μLReversePrimer(10μM)0.4μLRNasefreedH2O6.6μL50×ROXReferenceDye1.6μLmiRNA第一链cDNA1.0μLTotalVolume20μL25 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制4.在PCR仪上设置程序为：94°C2min94°C20sec40cycles60°C34secMeltCurveStage5.利用ΔΔCt法(Bookout,etal.,2006)计算miRNA相对表达量。2.1.9荧光素酶报告质粒的构建及荧光素酶试验2.1.9.1荧光素酶报告质粒的构建为了确定miR-26a的结合位点是否存在于PRRSV基因组中，我们使用购自Promega公司的pGL3-Control质粒进行荧光素酶试验。如图3.1所示，该质粒在luc+基因终止之后的非翻译区1934位点处含有XbaI酶切位点。图2.1pGL3-Control荧光素酶报告载体质粒图谱Fig.2.1pGL3-ControlLuciferaseReporterVectorcirclemap.为方便后续连接，我们在其后方插入PstI位点。使用到的突变引物对有PGL3-PstI-F和PGL3-SR2465。其序列如下：PGL3-PstI-F，5’-GCTCTAGACTGCAGGCGGCCGGCCGCTTCGAGC-3’；PGL3-SR2465，5’-TCAAGGGCATCGGTCGACGGATCC-3’。具体PCR体系如下：TaKaRaLATaq(5U/μL)0.5μL2+10×LAPCRBufferII(MgPlus)5.0μLdNTPMixture(2.5mMeach)4.0μLPGL3-PstI-F(10μM)1.0μLPGL3-SR2465(10μM)1.0μLPGL31.0μL去离子水37.5μL反应总体积50.0μL26 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制PCR反应条件为：94°C3min94°C30sec58°C30sec30cycles72°C1min72°C10min将PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳鉴定是否正确，切下条带后，用胶纯化回收试剂盒（华舜）进行回收，操作步骤参见说明书。将质粒pGL3和回收的产物同时经BamHI/XbaI酶切，体系如下：BamHI2.0μLXbaI2.0μL10×NEBBuffer5.0μLddH2O21.0μL回收产物20.0μL反应总体积50.0μLBamHI2.0μLXbaI2.0μL10×NEBBuffer5.0μLddH2O39.0μLpGL32.0μL反应总体积50.0μL将上述体系置于37°C水浴5h，核酸电泳后，回收PCR突变的DNA片段和pGL3质粒酶切后的大片段，进行体外连接，体系如下：10×T4Ligasebuffer1.0μLNEBT4DNAligase1.0μLPCR突变片段7.0μLpGL3大片段1.0μL反应总体积10.0μL将连接体系置于16°C恒温连接仪过夜，产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，步骤参照天根公司说明书。具体如下：取出感受态细胞冰上融化，将连接产物全部加入其中并小心轻轻吹打混匀；冰上放置30min，42°C水浴热击90s，迅速置于冰上放置3-5min；再加入900μL无抗性的LB液体培养基轻匀，置于37°C摇床振荡培养1h。将菌液离心浓缩后全部涂于含100ng/ml氨苄青霉素的LB平板，置于37°C恒温培养箱过夜。挑取菌落，接种于抗性LB液体培养基，置于37°C摇床200rpm振荡培养约12h。使用购自QIAGEN公司的QIAprep®SpinMiniprepKit小量抽取质粒，鉴定后送生工生物工程有限公司进行测序。突变成功的质粒中同时含有XbaI/PstI酶切位点，将其命名为pGL3-PstI。根据vJX143（GenBank登录号：GQ475526）的核苷酸序列，利用Primer5.0软件设计用于27 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制构建荧光素酶报告质粒的含有PRRSV基因组不同片段（见图2.2）的20条引物。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，用RNase-free的超纯水将其溶解为贮存浓度100μM及工作浓度10μM的液体，贮存于-20°C冰箱备用。引物序列参见表2.3。图2.2含有PRRSV基因组cDNA片段的PGL3荧光素酶报告载体的构建图解Figure2.2.SchematicrepresentationofthePRRSVgenome.ViralcDNAfragmentsusedforconstructingpGL3luciferasereportersareindicated.以PGL3-5UTR为例，介绍构建荧光素酶报告质粒的方法。具体PCR体系如下：TaKaRaLATaq(5U/μL)0.5μL2+10×LAPCRBufferII(MgPlus)5.0μLdNTPMixture(2.5mMeach)4.0μLPGL3-5UTR-F(10μM)1.0μLPGL3-5UTR-R(10μM)1.0μLpJX1431.0μL去离子水37.5μL反应总体积50.0μLPCR反应条件为：94°C3min94°C30sec60°C30sec30cycles72°C30sec72°C5min表2.3构建荧光素酶报告质粒所用引物Table2.3.Sequenceofoligonucleotideprimersforconstructingluciferasereporters.PrimerSequence(5′-3′)PGL3-5UTR-FGCTCTAGAATGACGTATAGGTGTTGGCTCPGL3-5UTR-RTACTGCAGGGTTAAAGGGGTGGAGAGACCPGL3-nsp1-FGCTCTAGAATGTCTGGGATACTTGATCGGTPGL3-nsp1-RCGCTGCAGGTACCACTTATGACTGCCAAAC28 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制表2.3（续表）PrimerSequence(5′-3′)PGL3-nsp2-FATTCTAGAGGTGCCGGAAAGAGAGCAAGGAPGL3-nsp2-RAACTGCAGCCCTGAAGGCTTGGAAATTTGCPGL3-nsp3-FACTCTAGAGGAGGCCCACACCTCATTGCTGPGL3-nsp3-RATCTGCAGCTCAAGGAGGGACCCGAGCTGAPGL3-nsp4-FGCTCTAGAGGCGCTTTCAGAACTCAAAAPGL3-nsp4-RACCTGCAGTTCCAGTTCGGGTTTGGCAGCAPGL3-nsp5-FGCTCTAGAGGAGGCCTTTCCACAGTTCAACPGL3-nsp5-RTCCTGCAGCTCGGCAAAGTATCGCAAGAAGPGL3-nsp6-FGATCTAGAGGAAAGTTGAGGGAAGGGGTGTPGL3-nsp6-RTACTGCAGCTCATGACTCATCCCGCAGGPGL3-nsp7-FGCTCTAGATCGCTGACTGGTGCCCTCGPGL3-nsp7-RTCCTGCAGTCCCACTGAGCTCTTCTATTPGL3-nsp8-FGCTCTAGAGCCGCCAAGCTTTCCGTGGAGCPGL3-nsp8-RTCCTGCAGCAGTTTAAACACTGCTCCTTAGPGL3-nsp9-FGATCTAGAGCCTGACTAAGGAGCAGTGTTTPGL3-nsp9-RGCCTGCAGCTCATGATTGGACCTGAGTTTTPGL3-nsp10-FGCTCTAGAGGGAAGAAGTCCAGAATGTGCGPGL3-nsp10-RTCCTGCAGTTCCAGGTCTGCGCAAATAGPGL3-nsp11-FAATCTAGAGGTCGAGCTCCCCGCTCCCCAAPGL3-nsp11-RCGCTGCAGTTCAAGTTGAAAATAGGCCGTCPGL3-nsp12-FACTCTAGAGGCCGCCATTTTACCTGGTATCPGL3-nsp12-RCGCTGCAGTCAATTCAGGCCTAAAGTTGGTPGL3-ORF2-FGCTCTAGAATGAAATGGGGTCTATGCAAAGCPGL3-ORF2-RCGCTGCAGTCACCATGAGTTCAAAAGAAAAGPGL3-ORF3-FGCTCTAGAATGGCTAATAGCTGTACATTCCPGL3-ORF3-RAACTGCAGCTATCGCCGTGCGGCACTGAGAAPGL3-ORF4-FGCTCTAGAATGGCTGCGCCCTTTCTTTTPGL3-ORF4-RGCCTGCAGACTTAAACATTCAAATTGCCAGPGL3-ORF5-FACTCTAGAATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGPGL3-ORF5-RAGCTGCAGCTAGAGACGACCCCATTGTTCCPGL3-ORF6-FACTCTAGAATGGGGTCGTCTCTAGACPGL3-ORF6-RGCCTGCAGTTATTTGGCATATTTAACAAGGPGL3-ORF7-FACTCTAGAATGCCAAATAACAACGGCAAGCPGL3-ORF7-RAGCTGCAGTCATGCTGAGGGTGATGCTGTGPGL3-3UTR-FAATCTAGATGGGCTGGCATTCTTTGGCACPGL3-3UTR-RGCCTGCAGTTAATTACGGCCGCATGGTTC29 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制PCR产物经琼脂糖电泳后切下正确的条带并回收，接着将质粒pGL3-PstI和回收的产物同时经PstI/XbaI酶切，体系如下：PstI2.0μLXbaI2.0μL10×NEBBuffer5.0μLddH2O11.0μL回收产物30.0μL反应总体积50.0μLPstI2.0μLXbaI2.0μL10×NEBBuffer5.0μLddH2O39.0μLpGL3-PstI2.0μL反应总体积50.0μL在37°C反应5h后，跑核酸电泳并回收PCR产物和pGL3-PstI质粒酶切片段，进行体外连接，体系如下：10×T4Ligasebuffer1.0μLNEBT4DNAligase1.0μLPCR产物7.0μLpGL3-PstI酶切片段1.0μL反应总体积10.0μL在16°C恒温连接仪过夜连接，产物转化TOP10感受态细胞，步骤参照说明书。将菌液离心浓缩后全部涂于含抗性LB平板，置于37°C恒温培养箱过夜。待菌落长好，接种于抗性LB液体培养基，37°C摇床振荡培养约12h。®抽取质粒鉴定后送生工公司测序，将连接正确的质粒再次转化，使用QIAprepSpinMiniprepKit质粒抽提试剂盒提取一批高浓度荧光素酶报告质粒。使用NanoDropND-1000浓度分析仪测定质粒浓度并记录后，冻存于-20°C冰箱备用。2.1.9.2荧光素酶试验2.1.9.2.2荧光素酶报告质粒的转染将3.1.9.1中构建的20个荧光素酶报告质粒与miRNAmimics共转染入BHK-21细胞中，转®染试剂使用FugeneHD，步骤如下：1.当12孔板中的BHK-21细胞生长至70%时，开始进行转染。®®2.取适量1.5mLEP管，每管加入100μLOpti-MEMI和5μLFugeneHDReagent，涡旋振荡混匀。3.加入0.5μg报告质粒和4μLmiRNAmimics，轻轻混匀。30 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制4.静置20min。®5.从CO2培养箱中取出12孔板，PBS洗细胞1次，再加入900μLOpti-MEMI。6.将步骤3中的混合液逐滴加入孔中，置于5%CO2细胞培养箱中继续培养。7.每管3次重复，24h后测定。3.1.9.2.2荧光素酶报告分析系统利用荧光素酶分析系统（Promega）和ModulusMicroplateMultimodereader分析luc+酶活性。具体步骤如下：1.用ddH2O将PassiveLysisBuffer（PLB）稀释为1×工作浓度。2.向12孔板中每孔加入150μLPLB，室温孵育15min，冻于-80°C。3.融化后，分装到EP管中，12000rpm4°C离心1min。4.将上清小心吸出，转移到干净的EP管中。5.向微量96孔板中每孔加入20μL上清液，重复3个孔。6.使用ModulusMicroplateMultimodereader测定，参数设置为：Volume100μLDelay3secIntegration1sec7.用RelativeLuciferaseActivity表示酶活性。miR-26aLuciferaseActivityRelativeLuciferaseActivity=NCLuciferaseActivity2.1.10统计学分析差异显著性分析采用t-test，存在显著性差异分别记作*（P<0.05）、**（P<0.01）、***（P<0.001），不存在显著差异记作ns。2.2结果2.2.1miR-26a具有抗PRRSV作用为筛选具有抑制PRRSV复制作用的miRNA，我们根据前人文献报道选取了15种（见表3.1）在多个物种间保守且被证明在先天性免疫调节和/或抗病毒方面有作用的miRNA进行抗PRRSV功能验证。待MARC-145细胞生长至60%密度时，分别转染上述15种miRNA模拟体或阴性对照（NC）24h后，感染vAPRRS（MOI=0.01），分别于24h和48h时收集上清，测定其TCID50。在所有测试的miRNA中，我们发现转染miR-26a后PRRSV滴度大幅下降，而转染其它miRNA后PRRSV滴度与NC组相比无显著差异（图3.3）。31 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制图2.3在15种miRNA中miR-26a被证明可有效抑制PRRSV复制Fig.2.3MicroRNA(miRNA)screeningidentifiesmiR-26aasaninhibitorofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)replication.进一步，我们分别转染miR-26a/b的模拟体和抑制物，结果可以看出，转染抑制物可对病毒复制造成轻微促进，而miR-26a和miR-26b均具有抗PRRSV复制的作用，且miR-26a比miR-26b抑制作用更为显著（图2.4）。图2.4miR-26a对PRRSV抑制作用比miR-26b更为显著Fig.2.4miR-26aisamoreefficientsuppressorthanmiR-26bagainstPRRSVreplication.通过IFA试验可以看出，miR-26a组PRRSVN蛋白荧光仅呈零星存在，而NC组荧光则基本上遍布所有细胞，说明N蛋白表达情况与病毒滴度的结果相一致（图2.5）。32 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制图2.5miR-26a抑制PRRSVN蛋白表达Fig.2.5over-expressionofthemiR-26amimicsuppressedPRRSVNproteinexpressioninMARC-145cells.2.2.2miR-26a对不同基因型和不同毒力的PRRSV毒株均有抑制作用为了排除上述结果可能是基于某个特定的PRRSV毒株，我们选取了本实验室保存的两株北美型毒株，它们分别是HP-PRRSV毒株vJX143以及其在MARC-145细胞上的传代致弱毒株vJXM100，另选取了一株欧洲型毒株vSHE，对miR-26a的功能进行进一步验证。在转染miR-26a或NC之后，分别感染这三株病毒，在指定时间收集上清，并测定其在MARC-145细胞上的生长曲线。从结果可以看出，miR-26a对于这三株病毒复制均有显著抑制作用。在感染后12至96小时过程中，miR-26a组所有毒株的滴度几乎没有任何上升，说明miR-26a在该条件下对PRRSV复制呈完全抑制（图2.6）。图2.6miR-26a对不同基因型和不同毒力的PRRSV毒株均有抑制作用Fig.2.6over-expressionofthemiR-26amimicsuppressedPRRSVNproteinexpressioninMARC-145cells.33 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制2.2.3miR-26a对PRRSV的抑制作用与剂量相关为进一步确实以上发现，我们将miR-26a的转染量呈梯度递增，分别使用5nM、20nM、40nM和80nM，接着感染vAPRRS，并测定其在MARC-145细胞上的生长曲线和ORF7RNA水平。结果显示，随着miR-26a转染剂量的增加，其对PRRSV复制的抑制作用越明显（图2.7），同时qRT-PCR结果发现ORF7RNA表达也逐渐下降（图2.8）。当转染剂量达80nM时，ORF7RNA相对表达量被抑制为NC组的大约10%，而当剂量达120nM时，则不再能检测到ORF7RNA。图2.7miR-26a对PRRSV生长的抑制作用与剂量相关Fig.2.7PRRSVgrowthwasinhibitedasafunctionofthedoseofmiR-26amimic图2.8miR-26a对ORF7RNA水平的抑制作用与剂量相关Fig.2.8TheamountofORF7RNAlevelwasinhibitedasafunctionofthedoseofmiR-26amimic随后，我们从蛋白水平也衡量了上述发现。miR-26a的转染量按照图2.9中所示进行，感染病毒48h后固定细胞进行Western-Blotting试验，检测PRRSVN蛋白的表达。从结果可以看出，随着miR-26a转染量的增加，N蛋白的表达量逐渐下降，这与PRRSV生长和ORF7RNA水平相34 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制一致（图2.9）。图2.9miR-26a对PRRSVN蛋白表达的抑制作用呈剂量相关性Fig.2.9OverexpressionofmiR-26amimicsreducestheaccumulationofthePRRSVNproteininadose-dependentmanner.为排除miR-26a对PRRSV的抑制作用是由于其对细胞造成了损伤，我们将不同剂量的miR-26amimic（40nM、80nM和160nM）转染MARC-145细胞，对细胞活性和形态进行持续观察。结果证明，在转染剂量高达160nM的情况下，仍没有任何可评估的证据证明其具有细胞毒性。2.2.4miR-26家族在PAM细胞上抑制PRRSV复制接下来，我们检测了miR-26家族在PAM细胞上对PRRSV复制的影响。由于miR-26家族的序列在哺乳动物中是高度保守的。根据MicroRNA数据库（http://www.mirbase.org/）中登录的序列，在猴和猪细胞中，miR-26家族完全一致。既然我们已经从病毒生长、RNA水平、蛋白水平均证明了其在MARC-145细胞上对PRRSV的抑制作用，那么进一步验证其在PRRSV的体内嗜性细胞PAM上的作用究竟如何是非常有必要的。我们按照上文介绍的方法分离PAM细胞，培养过夜后分别转染miR-26a/b和NC。24h后感染vJX143，按照图中指示时间点收集上清并滴定，绘制生长曲线（图2.10）。图2.10转染miR-26家族后vJX143在PAM细胞上的生长曲线Fig.2.10ThegrowthdynamicsofHP-PRRSVisolatevJX143inPAMcellstransfectedwithmiR-26familymimics.从结果可以看出，与NC对照组相比，转染miR-26a后PRRSV在PAM上的生长被抑制了35 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制1,000倍以上直到感染后60h，而miR-26b也可对PRRSV造成约100倍左右的抑制作用直到感染后60h。显而易见，miR-26a比miR-26b具有更强烈抑制作用。以上结果证明，miR-26家族成员，特别是miR-26a，可以抑制PRRSV在PAM细胞上的复制。2.2.5种子区序列对于miR-26发挥抗PRRSV作用是必需的根据前人文献报道，miRNA-mRNA相互作用必需依靠miRNA5’端2-8位种子区序列与mRNA序列的完全互补(Bartel,2009)。因此，我们在miR-26a非种子区第1位、第9位、第1和9位进行突变（26-1A、26-9U、26-1A9U），另在miR-26种子区第2-6位进行突变（26a-m、26b-m）。首先在PAM细胞上转染miR-26a/b、所有突变体及NC对照，然后感染vJX143后24h，分别收集细胞上清、TRIZOL裂解细胞和冰甲醇固定，用以测定病毒滴度、提取RNA和IFA检测。从结果可以看出，miR-26a/b对于病毒产出有明显抑制作用，其滴度和ORF7RNA水平均极其显著地低于NC对照组（图2.11A-B）。三个非种子区突变组（26-1A、26-9U、26-1A9U）仍保持了其与原序列类似的抑制病毒产出和基因表达的能力（图2.11A-B）。相反地，两个种子区突变组（26a-m、26b-m）则丧失了该能力（图2.11A-B），说明miR-26种子区序列的保守性对于抑制PRRSV作用的发挥是必需的。接下来，我们用IFA检测了N蛋白表达情况。可以看出，与NC组相比，miR-26a/b组（图2.11C上）和非种子区突变体组（26-1A、26-9U、26-1A9U）（图3.11C中）均可明显抑制N蛋白表达，然而种子区突变体组（26a-m、26b-m）（图2.11C下）则对N蛋白表达没有影响。这与上述试验结果保持一致。图2.11种子区序列对于miR-26发挥抗PRRSV作用是必需的Fig.2.11Theanti-PRRSVactivityofmiR-26inPAMsrequiredseed-matchedsites.36 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制2.2.6PAM细胞感染PRRSV引起miR-26a/b上调我们接着检测了PAM细胞感染PRRSV后内源性miR-26a/b的表达情况。将vJX143以MOI=0.01感染PAM细胞，并在指定时间点裂解细胞提取总RNA。按照2.1.8..2和2.1.8.3中介绍的方法，对miRNA进行反转录和qPCR检测。从结果可以看出，miR-26a和miR-26b的表达趋势抑制，且随着感染时间增加，miR-26a/b持续上调，至48hpi，miR-26a/b相对表达量是未感染组的大约2倍（图2.12）。图2.12PAM细胞感染PRRSV后miR-26a/b的相对表达量Fig.2.12Time-courseofmiR-26a/bexpressionafterPRRSVinfection.2.2.7miR-26a不与PRRSV基因组直接结合因为直接与RNA病毒基因组结合是miRNA发挥抑制病毒作用的一个常见机制(Jopling,2010;Lecellier,etal.,2005)，我们将PRRSV基因组分段（5’UTR、nsp1-nsp12、ORF2-ORF7和3’UTR）克隆到了pGL3-Control载体的luc+基因下游3’UTR处。如果PRRSVcDNA片段中含有miR-26a靶序列，那么含有该片段的质粒luc+基因的表达则将被抑制；反之，luc+基因表达则不受影响。我们用分别共转染miR-26a与共转染NC的比值来衡量这两种可能，如果luc+基因表达被抑制，则该比值将显著下降。根据结果（图2.13）可以看出，luc+基因表达没有被抑制，证明miR-26a不与PRRSV基因组直接结合。2.2.8miR-26a上调I型干扰素及干扰素刺激基因的表达虽然我们未发现miR-26a与PRRSV基因组有直接作用，但是通过qRT-PCR检测，我们发现与NC组相比，其对I型干扰素却有着明显的上调作用（图2.14A），尤其是干扰素刺激基因MX1和ISG15均有极其显著的上调表达（图2.14B）。在未感染PRRSV的PAM细胞上，转染miR-26a也可以引起上述基因的一定上调。IFN-α在PRRSV感染和未感染的PAM细胞中分别有约1.6倍和4.9倍的上调，而IFN-β则分别上调了1.6倍和2.8倍（图2.14A-B）。ISG15在PRRSV感染和未感染的PAM细胞中分别有约3.5倍和3.6倍的上调，而MX1则分别上调了2.2倍和2.4倍（图2.14A-B）。37 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制在MARC-145细胞上，这种miR-26a引发的上调作用更为强烈。在PRRSV感染和未感染的MARC-145细胞中，IFN-α分别上调了4.4倍和9.1倍，而ISG-15则上调了9.8倍和20.4倍（图2.14C）。相对地，转染NC或者miR-26a抑制物，均不能上调上述基因（图2.14C）。这证实此上调作用是由于miR-26a特异导致的。图2.13miR-26a不与PRRSV基因组直接结合Fig.2.13miR-26adoesnotdirectlytargetthePRRSVgenome.图2.14miR-26a上调I型干扰素及干扰素刺激基因的表达Fig.2.14miR-26aincreasestheexpressionoftypeIIFNandtheIFN-stimulatedgenesduringPRRSVinfection.38 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制2.3讨论近年来，越来越多证据显示宿主细胞miRNA在先天性/获得性免疫应答以及宿主-病原相互作用的复杂网络中均有重要的调控作用。在此，我们鉴定miR-26a是PRRSV复制的有效抑制物，且其与PRRSV没有直接的结合作用（图2.3和2.13）。过表达miR-26a可以抑制PRRSV在MARC-145细胞上的复制及病毒基因的表达（图2.4和2.5），而该作用也同样体现在PRRSV的天然宿主细胞PAM上（图2.10），说明这一发现的生物相关性。MiR-26a属于一个广泛存在且高度保守的miRNA家族，其序列在脊椎动物中具有极高同源性(Griffiths-Jones,etal.,2008)。已有报道显示，miR-26a对细胞增殖分化有着重要的调控作用，其已经确定的靶基因包括SMAD1转录因子、骨骼肌细胞分化抑制剂Ezh2基因等(Luetal.,2011;Luzietal.,2008;Zhangetal.,2011)。miR-26a对主要免疫器官和骨骼方面的多重作用，提示了其作为临床治疗工具的潜在可能性。但至今为止，没有任何证据显示其在调节病毒复制方面的作用。我们的结果首次证明miR-26a能在体外抑制PRRSV复制，进一步证实其多重功能也包括参与抑制病毒感染。通过将PRRSVVR-2332株感染PAM细胞并进行Illumina深度测序，Liu等人总结了小RNA在12hpi、24hpi和48hpi的表达情况，以此来揭示miRNA在PRRSV感染后的相关变化(J,etal.,2013)。经过数据统计分析，共有40种细胞miRNA呈显著差异表达。miR-30a-3p、miR-132、miR-27b*、miR-29b、miR-146a和miR-9-2这六种miRNA的表达量在多个时间点都有变化。然而miR-26a在PRRSV感染后的变化情况在此文献中并未被提及。在本研究中，我们发现miR-26a相对表达量在PRRSVvJX143感染PAM细胞后期（48hpi）上调至空白细胞的大约2倍（图2.12），提示这可能是细胞抵抗病毒感染的一种保护机制。我们知道，宿主细胞miRNA调控病毒复制的一种机制就是通过序列完全或部分互补配对的方式，直接结合在病毒的基因组或者mRNA上，降解转录产物或者抑制蛋白表达进而起到基因沉默的作用。但是，PRRSV作为一种快速演化的RNA病毒，其相对高的突变速率极大限制了这种以RNAi为基础的抗病毒治疗的相关应用。另一方面，miRNA也可以间接作用于细胞的某个因子，常常可以起到影响细胞内通路和调节免疫应答的作用，从而间接干扰病毒的生命周期(Triboulet,etal.,2007)。在本章中，我们通过荧光素酶报告试验发现，共转染miR-26a不影响含有不同PRRSVcDNA不片段的报告质粒luc+基因的表达，进而证明了miR-26a不与PRRSV基因组RNA直接结合（图2.13）。此外，虽然北美型和欧洲型PRRSV仅有60%的序列同源性(Forsberg,2005)，但过表达miR-26a却对两型PRRSV均有抑制作用。这个结果让我们推测miR-26a可能作用于某个细胞组分而间接起到抗病毒作用。I型干扰素（IFN）是一种强有力的抗病毒细胞因子。一般情况下，模式识别受体可以识别病毒成分，并通过信号分子的级联作用，触发IFN上调表达(Sun,etal.,2012)。但在PRRSV感染的猪体内，即便检测到大量的病毒RNA，IFN-α的表达水平却仍然很低，呈现明显的先天性免疫应答抑制。PAM细胞作为PRRSV体内感染的主要嗜性细胞，许多学者长久以来都在探索它对PRRSV感染的免疫应答机制。已有多项研究表明多个基因的表达都受到PRRSV感染的影响，包括MX1、USP、IFN-β、IL-10和TNF-α等(Albina,etal.,1998;Luo,etal.,2008;VanReeth,etal.,1999)。39 中国农业科学院博士学位论文第二章miR-26a通过激活I型干扰素通路抑制PRRSV复制总的来说，这些研究证明PRRSV感染后，通过抑制促炎性细胞因子表达和IFN-α的产生和分泌来对抗宿主的抗病毒免疫反应。但根据qRT-PCR结果所示，我们发现了PRRSV感染与过表达miR-26a在先天性免疫应答方面上的联系。如图3.13，无论在空白细胞或PRRSV感染细胞上，过表达miR-26a均可以促进IFNs和ISGs的上调表达。但在PRRSV感染的细胞上，这种上调作用更加强烈。我们推测，正是miR-26a激活了I型干扰素通路，重建了PRRSV感染所引发的免疫抑制环境，进一步抑制病毒感染和复制。同时，这种对IFNs和ISGs的上调作用是miRNA特异性的，因为我们同时检测了另外一种miRNA（miR-181b），则没有发现类似作用（数据未列出）。通过miR-26a诱导产生I型干扰素阻止病毒感染，进一步帮助病毒清除，这种作用机制使得病毒很难通过形成突变株而逃避miRNA的干扰作用，提示其临床应用的价值。本章研究还发现，向空白的MARC-145细胞和PAM细胞转染miR-26a，仍然可以诱导细胞IFNs和ISGs一定程度的上调（图2.13），这提示其作为广谱抗病毒miRNA的潜力。我们可以在未来的试验中，继续关注这个现象，探索miR-26a与其它病毒复制之间的关系。而发生这个现象的原因，则可能与最近研究发现的miRNA新功能有关。有文献报道，除了常规的转录后调控作用，miRNA仍有其它作用方式。例如，MiR-21、miR-29a和let-7b被发现有着双重功能：一方面，它们结合Ago蛋白并引发靶基因沉默；另一方面，它们可直接与TLRs相互作用。虽然目前没有试验证据，但miR-26a也有可能充当TLRs的配体从而激活IFNs(Chenetal.,2013;Fabbrietal.,2013;Lehmannetal.,2012)。综上，揭示miR-26a的靶基因以及进一步研究其多重功能仍是我们下一步工作的目标。总结本章内容，我们从病毒的生长特性、RNA水平、蛋白水平等各个方面全方位阐述了miR-26a抑制PRRSV复制的作用，并证明miR-26a不与PRRSV基因组直接结合，且可以上调I型IFN及其下游ISGs，提示它在临床上作为抗病毒药物的潜力，为未来防控PRRS感染打开了新的思路。40 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究细胞miRNA通过直接靶向病毒RNA或mRNA导致RNA降解或蛋白翻译受阻，干扰病毒感染和复制，是miRNA另一种重要的作用方式。例如，丙型肝炎病毒（HCV）可以利用肝细胞特异性miRNA（miR-122）介导的基因调控，结合病毒RNA的5’端非编码区，促进其复制(Jopling,etal.,2005)；let-7c通过直接结合在流感病毒（IV）M1(+)基因的3’端非编码区，降解M1(+)cRNA，抑制IV复制(Ma,etal.,2012)。利用生物信息学软件，我们预测了PRRSVvJX143基因组上潜在的miRNA靶位点，结果发现其5’末端第155-162位核苷酸与miR-130种子区（SeedRegion）以7mer-m8的结合方式完全互补配对。那么miR-130与PRRSV复制有什么关联，这种关联是否确实如我们预测的结合作用所导致，其在抗PRRSV感染方面又发挥着什么功能？本章节将通过一系列试验对以上问题逐一解答。3.1材料与方法3.1.1细胞、病毒和质粒MARC-145和BHK-21细胞，来源和培养方法见第二章2.1.1。PAM细胞，分离步骤和培养条件见第二章2.1.1。vAPRRS（GenBank登录号：GQ330474）、vSHE（GenBank登录号：GQ461593）、vJX143（GenBank登录号：GQ475526）、vJXM100(GenBank登录号：GQ475526）均由本实验室保存，按照前文方法测定TCID50和制备病毒库，并贮存在-80°C冰箱中备用。含有PRRSV全基因组cDNA片段的pGL3荧光素酶报告质粒来自于第三章2.1.9.1，构建示意图参见图2.3。将其转化TOP10感受态细胞，挑取菌落，经LB培养后抽提质粒，使用NanoDropND-1000浓度分析仪测定浓度并记录后，冻存于-20°C冰箱备用。3.1.2试剂和仪器病毒上清RNA抽提试剂盒QIAgenViralRNAMiniKit购自QIAGEN公司；TaqMan荧光定TMTM量一步法PrimeScriptRT-PCR试剂盒、SYBR®PremixExTaq酶和第一链cDNA合成试剂盒®购于大连宝生物（TaKaRa）公司；细胞总RNA抽提试剂TRIZOL、转染试剂Lipofectamine2000®和Opti-MEMI购自Invitrogen公司；X-tremeGENEsiRNA转染试剂购自罗氏（Roche）公司；双荧光素酶检测系统购Promega公司；淋巴细胞分离液Histopaque1.077（Sigma）；红细胞裂解液购自碧云天公司；miRNA体内转染试剂RNAi-Mate购自上海吉玛生物制药技术有限公司；N蛋白单克隆抗体为西班牙马里兰Ingenasa公司惠赠；PRRSVN蛋白ELISA检测试剂盒（IDEXXPRRSVX3）。其化学试剂均为国药分析纯级产品。本研究中主要仪器有：荧光倒置显微镜（Olympus）；普通PCR仪（Bio-Rad）；Step-onePlus实时荧光定量PCR仪和7500荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems）；酶联免疫检测仪和NanoDropND-100浓度分析仪（Thermo）；另有BSL-2超净工作台、CO2细胞培养箱、核酸和蛋白电泳仪、凝胶成像仪、低温离心机、恒温摇床、恒温水浴锅、微量移液器、真空泵、超低温冰箱等。41 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究3.1.3miRNA的合成本研究中所使用的miRNA均来自上海吉玛生物制药技术有限公司合成且经过2’-甲氧修饰的双链RNA寡核苷酸，其序列均下载自sangermiRNA数据库（http://microrna.sanger.ac.uk/sequences）。miRNA模拟体、突变体、抑制物以及阴性对照NC的序列参加下表3.1，图中下划线标注为突变位点。表3.1本章节中所使用的miRNA模拟体、突变体和抑制物的序列Table3.1SequencesofmicroRNA(miRNA)mimics,mutantsandinhibitorsusedinthisstudy.NameSequence(5′-3′)miR-130a(130a)CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAUmiR-130b(130b)CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAUmiR-301a(301a)CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGCmiR-301b(301b)CAGUGCAAUGAUAUUGUCAAAGCmiR-454(454)UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUmiR-130a-mut(130a-m)CUCACGUUUGUUAAAAGGGCAUmiR-130b-mut(130b-m)CUCACGUUUGAUGAAAGGGCAUmiR-301a-mut(301a-m)CUCACGUUUAGUAUUGUCAAAGCmiR-301b-mut(301b-m)CUCACGUUUGAUAUUGUCAAAGCmiR-454-mut(454-m)UUCACGUUUAUUGCUUAUAGGGUmiR-130binhibitor(130b-inhi)AUGCCCUUUCAUCAUUGCACUGNCUUCUCCGAACGUGUCACGUTTNCinhibitor(NC-inhi)CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3.1.4miRNA转染和病毒多步生长曲线miRNA或NC转染PAM细胞和MARC-145细胞的剂量均为80nM（剂量依赖试验除外），使用的转染试剂为X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent，操作方法同第二章2.1.5。为分析不同处理对PRRSV复制的影响，在感染病毒后每隔12h收集上清0.2mL/孔，并根据Reed-Muench法，测定所收集病毒上清的滴度，计算TCID50并绘制病毒生长曲线(ReedandMuench,1938)。3.1.5间接免疫荧光试验（IFA）本试验旨在分析转染miR-130或NC后，PRRSVN蛋白表达有何差异，其操作方法同第三章2.1.6。3.1.6SDS-PAGE和WesternBlotting转染miR-130b或NC24h，感染vJX143（MOI=0.01）48h后用含有0.5mMNEM的蛋白裂解液冰上裂解MARC-145细胞并进行蛋白变性。SDS-PAGE和WesternBlotting具体操作方42 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究法参见第二章2.1.7。3.1.7RNA分离提取和实时定量PCR（qRT-PCR）3.1.7.1细胞总RNA的分离提取及反转录®PAM细胞和MARC-145细胞总RNA的分离提取使用TRIZOL法，具体操作步骤同第二章2.1.8.1。使用Nanodrop浓度分析仪对提取的总RNA进行定量，每个样本取1μg，使用购自大连宝生TM物公司的PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒在PCR仪上进行反转录（方法参见第二章2.1.8.1），将制备好的cDNA冻于-20°C备用。3.1.7.2细胞miRNA的分离提取及反转录PAM细胞miRNA分离方法同第二章2.1.8.1。为检测miRNA内源含量，使用购自天根生物miRcutemiRNA第一链cDNA合成试剂盒进行3’末端加poly(A)尾，并对poly(A)尾修饰的miRNA进行反转录（方法参见第三章2.1.8.2），将制备好的miRNA第一链cDNA冻于-20°C备用。3.1.7.3实时定量PCR检测3.1.7.3.1ORF7、IFN-α/β和TNF-α的qPCR检测将3.1.7.1中制备好的cDNA室温融化，利用Step-onePlusreal-timePCRsystem(Applied®TMBiosystems)和SYBRPremixExTaq(Takara)进行qPCR反应。本试验中所使用的引物序列见第二章表2.2，反应体系和操作方法见第二章2.1.8.3.1。TNF-α的上下游引物分别为：TNF-α-F，5’-ACCACGCTCTTCTGCCTACTGC-3’；TNF-α-R，5’-TCCCTCGGCTTTGACATTGGCTAC-3’。利用ΔΔCt法(Bookout,etal.,2006)计算ORF7RNA、IFN-α/βmRNA和TNF-αmRNA相对表达量。PAM细胞试验以GAPDHmRNA水平为内参，MARC-145细胞试验以β-actinmRNA水平为内参，其引物序列也参见表2.2。3.1.7.3.2miRNA的qPCR检测将3.1.7.2中制备好的miRNA第一链cDNA室温融化，利用Step-onePlusreal-timePCRsystem和miRcutemiRNAqPCR检测试剂盒进行qPCR反应（具体操作步骤参见第二章2.1.8.2）。本试验中所使用的miRNA上游引物同样购自天根，并以通用表达的RNAU6作为内参，利用ΔΔCt法(Bookout,etal.,2006)计算miRNA相对表达量。3.1.8Taqman探针一步法荧光定量RT-PCR3.1.8.1标准曲线的建立以pJX143为模板，以PRRS-F/PRRS-R为引物（序列见表4.2），进行PCR扩增。将PCR产43 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究物切胶回收后连接到pBS-TVector中，转化TOP10感受态。阳性重组质粒经EcoRI酶切鉴定并测序，正确的酶切产物经QIAquickPCRPurificationKit纯化，再按照MEGAScriptT3HighYieldCappedRNATranscriptionKit操作说明书进行体外转录。所得产物经纯化后测定浓度，即为RNA标准品。2根据下述公式，计算标准品的拷贝数，并以10倍系列稀释标准品，直至浓度为10copies/μL。28以RNA系列标准品(10copies/μL-10copies/μL)为模板，进行一步法RT-PCR检测，每个样品4个重复，根据Ct值和拷贝数绘制标准曲线，结果如图4.1。23-96.02×10×RNA浓度(ng/ul)×10拷贝数(copies/ul)=RNA长度×345表3.2一步法RT-PCR试验中使用的引物序列Table3.2SequenceofoligonucleotideprimersusedinOneStepRT-PCR.PrimerSequence(5’-3’)PRRS-FCCCTTTAACCATGTCTGGGAPRRS-RTTTGTCACTCACATGCAGGGJX-FCCAGGTCTACTGCACACGATGJX-RTTTTCACTAGTCATTCGTGCJX-ProbeFAM-CTCCGGTGGACGTTGCCAC-TAMRA图3.1一步法荧光定量RT-PCR的标准曲线Fig.3.1StandardcurveofonestepfluorescentquantitativeRT-PCR.3.1.8.2血清中病毒载量的检测TM利用采用7500荧光定量PCR仪和One-StepPrimeScriptRT-PCRKit，具体方法如下：1.冰上预冷1.5mLEP管，按照下述体系配置RT-PCR反应液；44 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究2×OneStepRT-PCRBufferIII10μLTaKaRaExTaqHS(5U/μL)0.4μLPrimeScriptRTEnzymeMixII0.4μLJX-F(10μM)0.4μLJX-R(10μM)0.4μL®TaqManJX-Probe0.8μL50×ROXReferenceDyeII0.4μLViralRNA2.0μLRNaseFreedH2O5.2μLTotalVolume20μL2.在7500RealtimePCR仪上设置程序为：Stage1、2：反转录反应42°C5min94°C10secStage3：PCR反应94°C20sec40cycles60°C34sec23.根据图3.1中公式y=-4.4221x+44.707(R=0.9983)，计算血清中病毒拷贝数。3.1.9miR-130靶位点的验证3.1.9.1荧光素酶报告质粒与miR-130共转染为鉴定miR-130的靶位点是否存在于PRRSV基因组RNA中，将2.1.9.1中构建的20个荧光素酶报告质粒与miR-130或者NC共转染入BHK-21细胞中，转染试剂使用Lipofectamine2000（Invitrogen），方法同第二章2.1.9.2.1。转染24h后，利用荧光素酶分析系统和ModulusMicroplateMultimodereader分析luc+酶活性，具体步骤参见第二章2.1.9.2.2，用RelativeLuciferaseActivity表示酶活性。miR-130Firefly/RenillaLuciferaseActivityRelativeLuciferaseActivity=NCFirefly/RenillaLuciferaseActivity3.1.9.2pGL3-5UTR-mut的构建为进一步证明miR-130的靶位点存在于PRRSV5’UTR中，我们利用下游PstI位点设计突变引物，使用PCR方法将pGL3-5UTR质粒的155-162位进行反义突变（TTGCACTG→AACGTGAC），再利用上游XbaI位点进行双酶切和连接，构建了pGL3-5UTR的突变质粒，命名为pGL3-5UTR-mut，并检测此突变对luc+基因表达的影响。3.1.10动物体内试验3.1.10.1试验动物45 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究选取4周龄仔猪，购自上海崇明某种猪场。试验前，首先分离血清并提取RNA和DNA，利用PCR检测（引物由本实验室设计并保存）确定其为PRRSV、CSFV、PCV抗原阴性，再利用HerdCheckPRRSX3抗体检测试剂盒（IDEXX）检测PRRSVN蛋白抗体为阴性。PRRSV抗体检测具体操作步骤根据说明书进行并稍加调整，简述如下：1.将97.5μL抗体稀释液加入ELISA板中，再加入2.5μL待检血清，进行40倍稀释；2.向反应孔中加入试剂盒中提供的阳性对照和阴性对照各100μL，并各做两个重复；3.室温条件下（18-25°C），孵育30min，在以下各步骤中，注意保持加样先后顺序不变；4.尽量拍干反应孔中液体，每孔加入约300μL洗涤液，水平振摇5min；5.步骤4重复5次，且每次都尽量拍干液体；6.向反应孔中加入HRP标记的抗猪IgG100μL，室温孵育30min；7.重复步骤4和5；8.向反应孔中加入TMB底物反应液100μL，室温孵育15min，保持避光；9.向反应孔中加入终止液100μL；10.用酶标仪读取650nm吸光值，记录数据并计算S/P值，小于0.4则判为阴性。3.1.10.2试验分组及免疫攻毒将检测合格的仔猪12头随机分3组分栏饲喂，尽量减小应激，再开始试验。具体分组及处理®见表3.3。miR-130b模拟体和NC对照由上海吉玛生物制药技术有限公司合成，溶解在Opti-MEMI®中，-80°C保存。试验0天早晨，按照表4.2对每组仔猪进行滴鼻给药（miR-130b、NC、Opti-MEMI），采用RNAi-Mate体内转染试剂（操作方法参见说明书）且剂量为1.5mg/kg体重。给药后6h，5对B组和J组仔猪以滴鼻的方式攻毒（vJX143，3×10TCID50/头）(Wang,etal.,2013b)，对C组仔猪鼻腔接种2mLDMEM。攻毒后第5天，采用同样剂量和方式，分别对B组、J组仔猪进行加强给药。攻毒后21天，剖杀所有存活仔猪，采集血液和组织并妥善保存，以便于下游试验。表3.3动物试验分组和免疫攻毒剂量Table3.3Animalexperimentalgroups,immunizationandviruschallengedoses.试验处理试验分组0天5天21天滴鼻给药及攻毒加强滴鼻给药全部剖杀B组0hmiR-130b5miR-130b采集血液和组织病料(B1,B2,B3,B4)6h3×10TCID50/头（心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结、J组0hNC5NC肠系膜淋巴结等），一(J1,J2,J3,J4)6h3×10TCID50/头式两份，分别保存于10%中性甲醛溶液®®C组0hOpti-MEMI2mL/头Opti-MEM2mL/和-80◦C冰箱(C1,C2,C3,C4)6hDMEM2mL/头头3.1.10.3体温测定与状态观察46 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究每天监测仔猪直肠温度变化（0-21天），并仔细观察仔猪临床症状和死亡情况，包括是否咳嗽、呼吸困难、皮肤潮红、寒颤、发热、食欲下降等。3.1.10.4血液和组织采集固定攻毒后3、7、10、14、21天，对三组仔猪均进行前腔静脉釆血，分离血清冻存于-80°C。当仔猪出现死亡时，及时采血和解剖，记录病变情况并打分。采集心、肝、脾、肺、肾、脑、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结等，一式两份。一份置于冰上带回实验室，用于研磨和抽提RNA；另一份直接固定于10%中性甲醛溶液，用于制作病理切片。3.1.10.5细胞分离PAM细胞的分离方法见第二章2.1.1，由于PAM细胞不需要继续培养，仅用作提取RNA，故不需无菌操作。PBMC细胞取自6周龄阴性猪，具体分离步骤如下：1.将淋巴细胞分离液（Sigma）恢复至室温，取4ml加入尖底玻璃管，将血浆沿管壁小心加入，使其处于分离液上层，切勿打乱液体平衡；2.常温400×g离心15min；3.取出玻璃管，可见中层细胞呈淡黄色雾状，即外周血淋巴细胞，用灭菌长针头将该层细胞吸出至另一装有PBS灭菌玻璃管，200×g低温离心10min；4.离心后分两层，红细胞层和淋巴细胞层，小心倒出上层液体，再加入2mL红细胞裂解液，吹打约2min，轻柔混匀，200×g低温离心10min；5.弃上清，加入PBS约4mL，轻轻吹打，200×g低温离心10min；6.重复步骤5；7.弃上清，加入适量Trizol，吹散细胞，待提RNA。3.1.10.6病毒体内生长曲线利用QIAgenRNeasyminikit提取3天、7天、10天、14天和21天血清RNA，具体操作步骤如下：1.每份血清取300μL，加入600μL裂解液RLT，涡旋振荡；2.加入无水乙醇430μL，上下颠倒混匀；3.分两次转移入收集柱中，每次700μL，10000×g离心30s，弃废液；4.加入BufferW1700μL，10000×g离心30s，弃废液；5.加入BufferRPE500μL，10000×g离心30s，弃废液；6.重复步骤5；7.更换新的2mL收集管，离心2min；8.将收集柱转移到新1.5mLEP管上，向滤膜中心逐滴加入30μLRNase-freewater（55°C预热），静置5min，10000×g离心2min，保存于-80°C备用；9.用TaqMan探针一步法荧光定量RT-PCR测定各样品中含有病毒拷贝数，绘制PRRSV体47 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究内生长曲线。3.2结果3.2.1软件预测PRRSV5’UTR含有miR-130潜在结合位点为了找到PRRSV基因组RNA上可能存在的miRNA结合位点，通过在线工具ViTa（http://vita.mbc.nctu.edu.tw/）和RegRNA（http://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index.php）对经典毒株vAPRRS和高致病性毒株vJX143均进行了预测。在预测结果中，我们注意到仅有miR-130的结合位点位于PRRSV5’UTR。这个结果让我们联想到了一个miRNA与病毒相互作用的经典例子，即miR-122通过结合在HCV5’UTR促进病毒复制。而通过查阅文献我们发现，miR-130a被证明在人肝癌细胞系可以上调I型干扰素通路并同时拮抗细胞miR-122的产生，进而抑制HCV的复制。那么miR-130与PRRSV复制之间的关系又是怎么样的呢？图3.2miR-130结合PRRSV基因组模型及其保守性分析Fig.3.2AmodelofmiR-130targetingPRRSVgenomicRNA.Inthismodel,wehypothesizedthatmiR-130couldtarget8nucleotidesintheviral5’UTRasindicated.首先，我们分析了miR-130在PRRSV基因组上的潜在结合位点。如图4.2A所示，软件预测PRRSV5’UTR非翻译区第155-162位核苷酸与miR-1305’端第1-8位完全互补配对（图中以miR-130b为例）。这种配对方式被称为7mer-m8（图3.2A），且这段序列（5’-TTGCACTG-3’）在48 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究vJX143和vAPRRS中均存在。为分析其保守性，我们选取了24株PRRSV代表性毒株，其中包括21株北美型和3株欧洲型，涵盖经典毒分离株、经典疫苗株、高致病性毒株和传代致弱毒株。经MegAlignSoftware比对分析发现，这段序列的保守性在21株北美型毒株中达100%，而在3株欧洲型毒株中却是0%（图3.2B）。3.2.2miR-130家族均具有抗PRRSV作用根据MirBase数据库（http://www.mirbase.org/），miR-130家族共有五个成员，分别是miR-130a、miR-130b、miR-301a、miR-301b和miR-454，它们位于5’端的2-8位核苷酸（种子区）序列完全相同。为了探索miR-130家族与PRRSV复制之间的关系，我们分别合成这5条miRNA模拟体，并将其种子区序列反义突变，合成相应的miRNA突变体。在MARC-145细胞上，我们分别转染NC、miR-130家族模拟体和突变体（剂量均为80nM），24h感染vJX143（MOI=0.01）。36hpi时，收集病毒上清和提取细胞RNA，分别测定病毒滴度和ORF7相对表达水平。图3.3miR-130家族抑制PRRSV基因表达和病毒产出Fig.3.3miR-130familyinhibitsviralgeneexpressionandPRRSVprogenyproduction.结果显示，转染miR-130模拟体后PRRSVORF7相对表达量显著低于NC对照组，而转染miR-130突变体后ORF7相对表达量与NC组没有明显差异，证明miR-130有抑制PRRSV基因表达的作用（图3.3A和C）；同时，miR-130模拟体组的病毒滴度也显著低于NC组，而突变体组的病毒滴度却与NC组没有明显差异，证明miR-130同样可以抑制病毒产出（图3.3B和D）。49 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究从另一方面，以上结果也说明miR-130的种子区序列对其抑制PRRSV复制作用的发挥是不可或缺的。3.2.3miR-130b对PRRSV复制的抑制作用最强既然我们己经证明了miR-130家族在MARC-145细胞上均具有抗PRRSV作用，那么在同家族的五条miRNA中，哪一条抑制作用更强烈呢？另外，针对PRRSV的体内嗜性细胞PAM，miR-130家族的作用又是怎么样的呢？接下来，我们检测了miR-130家族在PAM细胞上对PRRSV生长曲线的影响。根据MirBase数据库（http://www.mirbase.org/），猪源细胞中miR-130家族的序列与猴源细胞是一致的。故在本试验中，我们使用同样的miRNA模拟体。按照第三章介绍的方法分离PAM细胞，培养过夜后，分别转染miR-130家族模拟体或阴性对照（NC）24h后，感染vJX143（MOI=0.01）。按照图中指示时间点收集上清并测定其滴度，绘制病毒多步生长曲线（图3.4）。从生长曲线可以看出，在PAM细胞上，同家族miRNA作用不甚相同，miR-130a/b对PRRSV的抑制作用略强于和miR-454。其中miR-130b对PRRSV的抑制作用最强，miR-130a作用次之，而miR-454的抑制作用最弱，miR-301a/301b居中。图3.4转染miR-130家族后vJX143在PAM细胞上的生长曲线Fig.3.4ThegrowthdynamicsofHP-PRRSVisolatevJX143inPAMcellstransfectedwithmiR-130familymimics.3.2.4miR-130b抑制PRRSVN蛋白表达通过上述试验证明在miR-130家族中，miR-130b表现出更强的抗PRRSV作用，所以后续试验我们将采用miR-130b作为主要的研究对象。首先通过间接免疫荧光试验验证miR-130b对PRRSVN蛋白的影响。转染miR-130b24h后，将vJX143分别以MOI=0.01感染MARC-145细胞和PAM细胞，36hpi用冰甲醇固定细胞。按照第二章2.1.6中步骤进行IFA检测。50 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究结果显示，两种细胞miR-130b组PRRSVN蛋白明显少于NC组荧光，说明N蛋白表达被miR-130b所抑制（图3.5）。图3.5miR-130b抑制PRRSVN蛋白表达Fig.3.5over-expressionofthemiR-130bmimicsuppressedPRRSVNproteinexpressioninbothMARC-145cellsandPAMcells.3.2.5miR-130b抑制作用的强弱与剂量相关为探究miR-130b的抑制作用是否与转染剂量相关，我们将转染量呈梯度递增（20nM、40nM和80nM），24h后感染vAPRRS，并测定其在MARC-145细胞上的生长曲线和ORF7RNA水平。结果显示，随着miR-130b转染剂量的增加，其对PRRSV抑制作用越明显（图3.6A）。同时，qRT-PCR结果显示ORF7基因相对表达水平也逐渐下降，且miR-130b的相对表达量远高于NC组（图3.6B）。随后，我们从蛋白水平也证明了上述发现。按照图3.6C中所示转染不同剂量miR-130b，48hpi后收集细胞蛋白，通过Western-Blotting试验检测PRRSVN蛋白的表达。从结果可以看出，随着miR-130b转染剂量的增加，N蛋白的表达量逐渐下降，这与PRRSV生长曲线和ORF7相对表达量相一致（图3.6C）。51 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究图3.6miR-130b对PRRSV抑制作用的强弱与剂量相关不同转染剂量的A.病毒生长曲线；B.ORF7相对表达量；C.N蛋白表达Fig.4.6PRRSVreplicationwasinhibitedasafunctionofthedoseandtransfectiontimeofmiR-130mimic.OverexpressionofmiR-130bmimicsreducesA.virusgrowth,B.theamountofORF7RNAlevelandC.theaccumulationofthePRRSVNproteininadose-dependentmanner.3.2.6miR-130b对不同北美型PRRSV均有抑制作用为了证明miR-130b是否与毒株有关，我们选取了实验室保存的几株病毒，包括：北美经典毒株vAPRRS，高致病性分离株vJX143，高致病性细胞致弱株vJXM100和欧洲经典毒株vSHE。根据软件预测结果，北美型PRRSV中均存在miR-130b的结合位点，而欧洲型PRRSV中则不存在。那么，miR-130b对于这几株病毒的作用是怎样的呢，我们将miR-130b转染至MARC-145细胞24h后，分别感染不同病毒并测定24hpi时病毒滴度（图3.7A）和ORF7（图3.7B）相对表达量。结果显示，对于不同北美型病毒，miR-130b均有强烈抑制作用；而对于欧洲型病毒，则与NC组相比在病毒产出方面均没有显著差异（图3.7A）。在ORF7基因表达上，vSHE也有大约20%被抑制，这个现象发生的原因还不清楚。综上，miR-130b对不同型PRRSV的抑制作用符合我们的预期，同时也可以推断出miR-130b可以发挥抑制作用与北美型PRRSV序列的特异性具有相关性。52 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究图3.7miR-26a对多株北美型PRRSV均有抑制作用Fig.3.7over-expressionofthemiR-26amimicsuppressedmultipletype2PRRSVstrainsinMARC-145cells.3.2.7miR-130b直接靶向北美型PRRSV5’UTR究竟miR-130b是否真的靶向结合了PRRSV基因组呢，这个疑问我们通过荧光素酶试验来证实。在第二章2.1.9中，我们已将vJX143全基因组分为20个片段克隆到了pGL3-Control质粒XbaI位点下游。如果miR-130b确实可以结合5’UTR，那么与含有该片段的质粒共转染，则会抑制荧光素酶基因的表达。于是，我们在BHK-21细胞上进行了该试验。图3.8miR-130b与北美型PRRSV5’UTR直接结合Fig.3.8miR-130bdirectlytargetsthe5’UTRoftype2PRRSV.53 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究首先，待细胞密度达60%左右，将0.5μg报告质粒、0.1μgpRL-CMV质粒和4μLmiR-130bmimics（或NC对照）共转染至BHK-21细胞，24h后用LysisBuffer裂解细胞检测荧光素酶表达情况。从结果可以看出，pGL3-5UTR与miR-130b共转染后，荧光素酶基因相对表达量被抑制为NC组约30%左右。而其他报告质粒与miR-130b共转染，荧光素酶基因相对表达量与NC组相比没有显著差异（图3.8A）。我们又将pGL3-5UTR质粒和将其155-162位反义突变（TTGCACTG→AACGTGAC）得到的突变质粒pGL3-5UTR-mut（图3.8B），分别与miR-130家族模拟体或突变体共转染BHK-21细胞，检测luc+活性。从结果可以看出，共转染5UTR和mR-130模拟体，luc+活性被抑制，同时共转染5UTR和miR-130突变体，则对luc+活性没有影响（图3.8C）；反之，共转染5UTR-mut和miR-130突变体，luc+活性被抑制，同时共转染5UTR-mut和miR-130模拟体，则对luc+活性没有影响（图3.8D）。以上结果证明，miR-130家族的结合位点位于PRRSV5’UTR第155-162位核苷酸。3.2.8miR-130b不激活IFN-α和TNF-α前人研究发现miR-130家族与先天性免疫密切相关。例如，miR-130a被证明在人肝癌细胞系可以激活I型干扰素通路并同时拮抗细胞miR-122的产生(Lietal.,2014)。另外，miR-130a也被证明在人子宫颈癌细胞系和Hela细胞系上均可以直接结合在TNF-α3’UTR上抑制TNF-α表达(Zhangetal.,2014a)。PAM作为一种巨噬细胞，不同于癌细胞系，那么miR-130b对IFN-α和TNF-α有什么影响呢？感染PRRSV后，又有什么变化呢？按照前文方法分离培养PAM细胞过夜后，转染miR-130或者NC作用24h，感染vJX143®作用36h，用TRIZOL将细胞裂解，提取总RNA，反转录进行荧光定量PCR，检测IFN-α和TNF-α的表达。结果证明，无论是在空白还是PRRSV感染后的PAM细胞上，miR-130均不能激活IFN-α和TNF-α的表达。图3.9miR-130b不能上调I型干扰素及TNF-α表达Fig.3.9miR-130bdoesn’tupregulatetheexpressionofIFN-αorTNF-α.54 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究3.2.9miR-130b抗PRRSV感染的体内试验3.2.9.1仔猪攻毒后体温变化及临床症状观察攻毒组（J组）仔猪攻毒后第三天开始出现发热，表现为食欲不振、精神沉郁、咳嗽、气喘、呼吸音加重，症状逐渐加重表现出持续高热、寒战、后肢无力、站立不稳、被毛明显粗乱无光泽、呈腹式呼吸、食欲废绝、极度消瘦、耳朵和臀部皮肤出现明显出血点，皮肤潮红。全过程一直伴随着超过40.5°C的持续高热，攻毒后第七天J组有2头仔猪死亡，第八天又死1头，至攻毒后第9天，J组仔猪全部死亡（图3.10C）；miR-130b组（B组）仔猪攻毒后未表现有明显临床症状，精神食欲和活动情况均良好。因为试验进行时是冬天，气温较低，该组仔猪在攻毒后前9天体温一直维持在39.0-39.5°C左右，直到第10天，体温突然升高超过40°C，并逐渐走高，有个别猪体温偶发超过40.5°C，维持3-4天后，又逐渐下降，最终恢复到40°C之下，到攻毒后第18天，所有猪只体温恢复到了正常水平（图3.10A）。临床表现上，伴随发热出现的时间，3头试验猪出现乏力、食欲下降、眼睑分泌物增多、咳嗽、消瘦的症状，随着体温恢复正常，食欲和体力又都逐渐恢复，精神状态也好转，至第21天，临床症状基本消失，但该组仔猪仍然整体偏瘦、皮肤粗糙、活动力不足。这其中1头仔猪除了以上表现外，还伴随腹泻症状，到第20天，该仔猪突然发生死亡（图3.10C）。另外1头仔猪除中间有几天食欲下降之外，体温和临床表现都没有明显异常。攻毒后第22天，将所有仔猪剖杀，采血液和病理组织，回实验室分析。空白组（C组）仔猪体温（图3.10A）和临床表现均未见异常，平均体温一直维持在39.5°C左右（图3.10B）；B组平均体温也低于40°C，显著低于J组平均体温（图3.10B）。图3.10动物体内试验体温及存活率统计Figure3.10Meanrectaltemperaturesandsurvivalintheanimalexpriment.55 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究3.2.9.2仔猪攻毒后组织切片观察将肺脏、脾脏、扁桃体、淋巴结用10%中性甲醛固定过夜后，用70%乙醇脱水，并进行病理切片HE染色，显微镜观察并拍照保存。结果可以看出，J组肺脏组织呈大叶性肺炎，还存在广泛肺淤血，肺实变，肺泡腔内、细支气管腔内大量中性粒细胞和单核细胞充塞，部分肺组织结构破坏，细支气管上皮细胞显著水肿，脾组织淤血，扁桃体和肠系膜内淋巴细胞轻度减少（图3.11上）；B组肺脏组织呈间质性肺炎，肺泡内有水肿液，局部有炎性细胞浸润，脾脏、扁桃体、淋巴结基本正常（图3.11中）；C组各组织均未见明显病理变化（图3.11下）。图3.11攻毒后21天组织病理变化Figure3.11HistopathologyanalysisfromthepigletsinfectedwithvJX143intheanimalexpriment.3.2.9.3病毒体内生长曲线56 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究利用上文中建立的Taqman探针一步法荧光定量RT-PCR方法测定各组血清中的病毒载量，绘制病毒体内生长曲线。从结果以看出见，B组血清中病毒的拷贝数在各个时间点均显著低于J组（图3.12），说明miR-130b在体内也可以强烈抑制PRRSV复制。图3.12动物体内PRRSV生长曲线Figure3.12GrowthdynamicsofvJX143inserumsamplesfromtheanimalexpriment.3.3讨论在本章节中，我们通过软件预测并试验证明了miR-130家族的抗北美型PRRSV的能力（图3.2），并通过动物体内试验发现滴鼻给药miR-130b可以明显缓解临床症状和病毒血症，而且可以形成部分的免疫保护（图3.10和3.11）。PRRSV作为套式病毒，其不连续的转录方式产生的基因组RNA有着长约3.5kb的非编码序列，每条亚基因组mRNA也有自身的非编码区(FangandSnijder,2010)，这给miRNA结合提供了非常大的可能性。目前已被证明可以直接靶向PRRSV基因组RNA影响其复制的miRNA有miR-181和miR-23(Guo,etal.,2013;Zhang,etal.,2014b)。另外，miR-505和miR-378被预测出可以结合但还没有试验验证(Zhang,etal.,2014b)。它们的结合位点都在基因组RNA的3’端非编码区。经过生物学信息软件预测，我们也发现有多种可能直接结合PRRSV基因组的miRNA，但是比较特别的是，仅有miR-130家族可以靶向5’端非编码区。这立即让我们联想到了miR-122与HCV这对经典的例子(Jopling,2010)。经试验证明，miR-130家族确实均能抑制PRRSV在细胞上的复制（图3.3），其中miR-130b作用最明显。miR-130家族五个成员miR-130a、miR-130b、miR-301a、miR-301b、miR-454具有相同的种子区序列，但抑制PRRSV的能力却不同。其中以miR-130a和miR-130b作用最强，而miR-454最弱（图3.4）。虽然这五个成员都是以7mer-m8方式（miRNA5’端2-8nt与mRNA完全互补配对）(Bartel,2009)与PRRSV基因组互补配对，但序列分析发现，除miR-454外，其它成员5’端1nt也与PRRSV互补配对。这提示我们更长的互补结合序列，对于miRNA发挥沉默靶目标mRNA的作用是有帮助的。在试验中我们发现，miR-130b在北美型多株病毒中都有抑制效果，然而对欧洲株病毒却效果不显著。我们选取了比较有代表性的24株PRRSV毒株，包括21株北美型和3株欧洲型，涵盖经典毒分离株、经典疫苗株、高致病性毒株和传代致弱毒株（图3.2），经序列比对分析发现，这段序列的保守性在21株北美型毒株中达100%，而在3株欧洲型毒株中却是0%。这个有趣的发57 中国农业科学院博士学位论文第三章细胞miR-130抗PRRSV感染的相关研究现为我们解释了可以针对多株北美型毒株均有抑制作用（图3.7）。然而，另有研究报道过miR-130a在人肝癌细胞系可以上调I型干扰素通路并同时拮抗细胞miR-122的产生，进而抑制HCV的复制(Li,etal.,2014)。那么如果miR-130在其它细胞系是否可以激活I型干扰素通路呢？试验证明，miR-130b不激活PAM细胞中IFN-α和TNF-α的表达（图3.9），这也提示我们，miR-130的抗PRRSV作用应该是通过直接靶向PRRSV特异性的结合位点，而非激活先天性免疫来实现的。由于miRNA是不具备抗原性的小分子，所以它们被认为有抗病毒治疗应用的潜在功效。例如，miR-122是目前为止最具有临床应用价值的肝脏特异性miRNA，它通过结合丙型肝炎病毒（HCV）5’UTR可以有效抑制HCV复制(Jopling,2010;Jopling,etal.,2005)，并阻断非人类灵长类动物的病毒血症(Lanfordetal.,2010)。在动物体内试验中，我们发现miR-130b滴鼻给药后明显延迟了仔猪PRRSV发病的时间，且有效缓解了持续高热和其它临床症状，血清中病毒含量显著低于攻毒对照组（图3.11）。与攻毒后9天就全部死亡的攻毒对照组相比，miR-130b组仔猪至攻毒后21天仍有75%存活，体温恢复正常且临床症状基本消失（图3.10）。这证明miR-130b在动物体内可以抵抗PRRSV的感染，起到了部分免疫保护的作用。关于滴鼻给药剂量、给药方式、攻毒剂量和时间都是初次尝试，故miR-130b在体内的抗PRRSV作用仍有许多更关键的细节需要进一步证明。但我们的结果揭示了miR-130b在体外和体内抑制PRRSV复制的生物相关性，给利用宿主miRNA进行抗病毒治疗的应用提供了一定试验依据。此外，RNA病毒较高的突变率让我们担心在过表达miR-130b的细胞中，进化选择压是否会引发PRRSV突变掉这段靶序列，以逃避miR-130b的直接结合。然而，与其它动脉炎病毒类似，PRRSV5’UTR被相信含有多个顺式作用元件可以调控病毒RNA合成的多个步骤(Gao,etal.,2012)。在EAV中，5’端包含LeaderTRS所在的茎环结构（LeaderTRSHarpin、LTH）就被证明在sgmRNAs转录中起关键作用。同时，LTH顶端的Loop结构被证明对PRRSV复制也是必不可少的，它非常突出的二级结构可以为LeaderTRS提供接头的便利(VanDenBornetal.,2004;vandenBornetal.,2005)。我们利用MfoldRNA在线预测时发现，PRRSV5’端第155-162位就位于LTH结构中，而突变这段序列会对LTH顶端Loop二级结构造成影响，这可能会影响顶端Loop结构作用的发挥。虽然二级结构预测的结果并不能保证完全正确，但是已有研究已经证明真实的RNA结构与预测的结构有极高一致性。这提示我们，也许第155-162位核苷酸对于PRRSV复制是必需的。下一步，我们可以利用实验室感染性克隆全长对这段序列进行一系列突变和改造，拯救病毒并分析其生物学特性以及验证miR-130b对突变病毒复制的影响，以更好地揭示miR-130b在结合5’UTR抑制PRRSV复制过程中的详细机制。总结本章内容，我们通过软件预测发现miR-130潜在的结合PRRSV能力后，在体内和体外试验中均证明了miR-130抑制PRRSV复制的作用。这种作用针对多株北美型PRRSV有效，却对欧洲型PRRSV无效。经验证其靶目标是位于北美型PRRSV5’端非翻译区155-162位的一段保守序列。体内试验证明miR-130b可以显著延缓和减轻PRRSV发病症状，且能形成部分免疫保护，提示我们这一发现的潜在临床应用价值。58 中国农业科学院博士学位论文第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索研究表明，病毒感染可以改变宿主miRNA的表达谱，这也是宿主-病原体相互作用的一个方面。而随着小RNA深度测序（SmallRNADeepSequencing）技术的发展，将病毒感染细胞前后miRNA表达谱信息完全鉴定出来已不再是难题(Jagadeeswaran,etal.,2010)。MARC-145细胞作为PRRSV体外感染最主要的传代细胞系，我们构建了vAPRRS感染MARC-145细胞前后的小RNA表达谱，并利用所获得的miRNA表达谱信息和实验室PRRSV全长感染性克隆将包含miRNA靶位点克隆到vAPRRS基因组中，尝试改变病毒的生长特性，将为我们从另一个角度提供利用miRNA抗病毒的新思路。4.1材料与方法4.1.1细胞、质粒与细菌MARC-145细胞，其来源和培养方法同前文所述相同。北美型PRRSV全长感染性克隆质粒pAPRRS（GenBank登录号：GQ330474）由本实验室保存，并经改造变为由真核生物启动子CMV启动，以方便质粒转染和病毒拯救，拯救出的病毒命名为vAPRRS(YuanandWei,2008)。为便于插入突变序列，又在ORF7终止密码子下游引入AscI酶切位点，命名为p7USC，其拯救病毒与亲本毒vAPRRS生长特性相一致，命名为v7USC(Tanetal.,2011)。大肠杆菌感受态细胞TOP10（TIANGEN）用于转化。4.1.2主要试剂®®®TRIZOLreagent、QIAprepSpinMiniprepKit和Opti-MEMI购自Invitrogen公司；TaKaRaLATaq™购自大连宝生物（TaKaRa）公司；限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购自NEB（北®京）公司；FugeneHD转染试剂购自Promega公司；N蛋白单克隆抗体SR30A购自RuralTechnologies公司；AlexaFluor568荧光标记的山羊抗鼠IgG（H+L）购自Invitrogen公司；本文所使用其它化学试剂（异丙醇、氯仿、无水乙醇等）均为国产分析纯产品。4.1.3主要仪器同第二章2.1.4。4.1.4病毒感染和总RNA提取将MARC-145细胞铺在T75中，待刚好长满时，感染保存的vAPRRS病毒（MOI=1），同时设置空白对照，吸附1h，更换为2%FBS的MEM培养基，置于CO2培养箱24h。病毒感染®组和空白对照组各做3个重复，每瓶细胞用2mLTRIZOL试剂裂解，按照说明书提取总RNA，具体方法参见第二章2.1.8.1。操作过程中应尽量注意无RNase处理，使用的试剂、枪头、EP管59 中国农业科学院博士学位论文第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索都使用无RNA酶的。得到的总RNA用NanoDrop测定其浓度，并跑琼脂糖凝胶RNA电泳，鉴定其28S、18S和5.8S完整性。4.1.5小RNA深度测序及数据分析感染病毒组和空白细胞对照组的总RNA鉴定合格后，送交华大基因科技（深圳）有限公司进行SmallRNA高通量测序，使用的测序平台是IlluminaSolexa。1.基于Solexa数字化和自动化平台，采用边合成边测序的方法，得到原始读取数（rawsequencingreads）。2.釆用分析软件并结合NCBI和miRbase等数据库，对rawsequencingreads进行处理与分析：(1)剔除低质量reads、污染reads和空载reads(只含有3’接头序列)；剔除3’adaptor序列；剔除长度不符的reads，并统计sRNA的长度分布；(2)对读取到的高质量序列进行RNA分类注释，包括rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等在内逐一分类统计，并分析mRNA降解片段和一些重复序列，以便于后续分析。(3)结合miRBase数据库比对，将已登录该数据库的已知pre-miRNA和成熟miRNA序列汇总；再结合NCBI数据库，与猕猴的基因组序列相比对，进行基因组定位，Genbank比对，Rfam比对，差异分析，靶基因预测，GO富集分析和KEGG通路分析；(4)最后根据基因组前体结构和侧翼序列分析是否存在新的miRNA；4.1.6miRNA选取与引物设计选取miR-21、let-7e、miR-185、miR-25、miR-505和miR-199分别代表不同丰度的细胞miRNA，利用pUSC7插入的AscI和下游的XhoI酶切位点，将其反向互补序列插入全长克隆ORF7下游。所选取的miRNA序列及突变引物序列见下表4.1和4.2（表中黑体字代表互补序列，下划线代表突变位点，斜体字为酶切位点，t代表target，c代表control）。表4.1本章节中所使用的miRNA序列及其反向互补序列Table4.1miRNAsandtheirreversecomplementarysequencesinthisstudy.miRNASequenceReverseComplementarySequencesReadsmiR-21UAGCUUAUCAGACUGAUGUUAACAUCAGUCUGAUAAGCUA2369620let-7eUGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUUAACUAUACAACCUCCUACCUCA279199miR-185UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGAUCAGGAACUGCCUUUCUCUCCA19621miR-26UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCUAGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA9789miR-505CGUCAACACUUGCUGGUUUCCUAGGAAACCAGCAAGUGUUGACG127miR-199CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCGAACAGGUAGUCUGAACACUGGG5560 中国农业科学院博士学位论文第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索表4.2构建含有miRNA结合位点的系列突变体所需引物Table4.2PrimersforconstructingmutationPRRSVscontainingmiRNAtargetsites.PrimerSequence(5′-3′)SF505-199-tTTGGCGCGCCAGGAAACCAGCAAGTGTTGACGGAACAGGTAGTCTGAACACTGGGTGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF505-199-cTTGGCGCGCCAGCATACTATCGAGAGTTGCCGGACCATGTCGCCTTAAGACTGCGTGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF185-26-tTTGGCGCGCCTCAGGAACTGCCTTTCTCTCCAAGCCTATCCTGGATTACTTGAATGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF185-26-cTTGGCGCGCCTCAGCATCAGGCTTTGTCACGAATCCTCTCGTGGAATAGTAGTATGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF21-tTTGGCGCGCCAACATCAGTCTGATAAGCTATGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF21-cTTGGCGCGCCTACGTCTGCCTCACAATCTATGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF7e-tTTGGCGCGCCAACTATACAACCTCCTACCTCATGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF7e-cTTGGCGCGCCGAGTACACGACCTACTAGCTTATGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF21-7e-tTTGGCGCGCCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACTATACAACCTCCTACCTCATGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF21-7e-7cTTGGCGCGCCTACGTCTGCCTCACAATCTAGAGTACACGACCTACTAGCTTATGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF21-7e-5cTTGGCGCGCCAACGTCTGCCTCACAAGCTAAAGTACACGACCTACTAGCTCATGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF21-7e-3cTTGGCGCGCCAACATCTGCCTCATAAGCTAAACTACACGACCTACTACCTCATGGGCTGGCATTCTTGAGGCSF21-7e-1cTTGGCGCGCCAACATCAGTCTCATAAGCTAAACTATACGACCTCCTACCTCATGGGCTGGCATTCTTGAGGCQstGAGTGACGAGGACTCGAGCGCATGCTTTTTTTTTTTTTT4.1.7突变病毒构建利用突变PCR的方法，扩增出含有miRNA反向互补序列的片段。具体PCR体系如下：TaKaRaLATaq(5U/μL)0.5μL2+10×LAPCRBufferII(MgPlus)5.0μLdNTPMixture(2.5mMeach)4.0μLSF(10μM)1.0μLQst(10μM)1.0μLp7USC1.0μL去离子水37.5μL反应总体积50.0μL61 中国农业科学院博士学位论文第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索PCR反应条件为：95°C3min95°C30sec55°C30sec25cycles72°C40sec72°C10min将PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳鉴定是否正确，条带正确的片段切下后，使用购自上海华舜生物工程有限公司的胶纯化回收试剂盒进行回收，操作步骤参见说明书。将质粒p7USC和回收的产物同时经AscI/XhoI酶切，体系如下：AscI2.0μLXhoI2.0μL10×NEBBuffer5.0μLddH2O21.0μL回收产物20.0μL反应总体积50.0μLAscI2.0μLXhoI2.0μL10×NEBBuffer5.0μLddH2O39.0μLp7USC2.0μL反应总体积50.0μL将上述体系置于37°C水浴5h，核酸电泳后，回收PCR突变的DNA片段和p7USC质粒酶切后的大片段，进行体外连接，体系如下：10×T4Ligasebuffer1.0μLNEBT4DNAligase1.0μLPCR突变片段7.0μLp7USC大片段1.0μL反应总体积10.0μL将连接体系置于16°C恒温连接仪过夜，产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，步骤参照天根公司说明书。具体如下：取出感受态细胞冰上融化，将连接产物全部加入其中并小心轻轻吹打混匀；冰上放置30min，42°C水浴热击90s，迅速置于冰上放置3-5min；再加入900μL无抗性的LB液体培养基轻匀，置于37°C摇床振荡培养1h。将菌液离心浓缩后全部涂于含100ng/ml氨苄青霉素的LB平板，置于37°C恒温培养箱过夜。挑取菌落，接种于抗性LB液体培养基，置于37°C摇床200rpm振荡培养约12h。®使用购自QIAGEN公司的QIAprepSpinMiniprepKit小量抽取质粒，鉴定后送生工生物工®程有限公司进行测序。将连接正确的质粒再次转化，使用QIAprepSpinMiniprepKit质粒抽提试剂盒提取一批高浓度荧光素酶报告质粒。使用NanoDropND-1000浓度分析仪测定质粒浓度并记62 中国农业科学院博士学位论文第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索录后，冻存于-20°C冰箱备用。4.1.8突变病毒拯救®采用DNA转染的方法拯救病毒，使用的转染试剂为FugeneHDReagent，待MARC-145细胞生长至80%左右时，开始进行转染。®®1.取适量1.5mLEP管，每管加入100μLOpti-MEMI和5μLFugeneHDReagent，涡旋振荡混匀；2.加入2μg突变质粒，轻轻混匀，低速离心；3.静置20min；®4.从CO2培养箱中取出6孔板，PBS洗细胞1次，再加入900μLOpti-MEMI；5.将步骤3中的混合液逐滴加入孔中，置于5%CO2细胞培养箱中继续培养；6.每个质粒做2个复孔，每隔12h收100μL上清用于后续滴定；7.显微镜每天观察CPE情况。4.1.9间接免疫荧光试验（IFA）为了检测不同突变病毒N蛋白的表达情况，将所有质粒转染MARC-145细胞24h后进行IFA。其具体步骤如下：1.弃去培养上清，PBS洗细胞2遍，加入冰甲醇550μL，放置于4°C固定20min；2.弃冰甲醇，PBS洗细胞3遍，加入PBS封闭液（含1%BSA）37°C放置30min；3.弃封闭液，PBS洗细胞5遍，加入N蛋白特异性单克隆抗体（SR30A，1:10000稀释）每孔500μL，37°C孵育2h，期间每隔30min摇晃一次；4.弃一抗，PBS洗细胞5遍，加入1:800稀释AlexaFluor荧光标记的羊抗鼠IgG每孔500μL，37°C孵育1h；5.弃二抗，PBS洗细胞5遍，加入200μLPBS，置于Olympus显微镜下观察荧光并拍照保存。4.1.10病毒多步生长曲线为了测定突变病毒转染MARC-145细胞后复制情况的差异，我们将4.1.7中收集的上清滴定TCID50并绘制曲线。其具体步骤如下：1.铺96孔细胞培养板，待细胞长成单层后，弃去细胞培养基；2.将收集的上清用MEM（含2%FBS）作10倍梯度连续稀释，将各稀释度的上清液加入到96孔板中，每孔150μL，4个重复。3.将接好毒的细胞板置于37°C培养箱，6天后用显微镜下观察并记录每个细胞孔CPE情况，使用Reed-Muench法计算TCID50(ReedandMuench,1938)。4.将各时间点收取的上清TCID50绘制成生长曲线。63 中国农业科学院博士学位论文第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索4.1.11突变病毒传代及测序将收集的上清在MARC-145细胞上进行连续5次病毒传代，采用QIAgenRNeasymini试剂盒提取P1、P3、P5上清的RNA，利用Qst作为下游引物，使用PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒在PCR仪上进行反转录。具体操作方法参见第二章2.8.1.1和第三章3.1.10.6。使用实验室保存的引物SF14841/SR15397进行PCR扩增，将产物连接到pMD-18T载体上，每个病毒每代随机选取10个克隆，送上海生工进行测序，比对分析结果分析突变病毒传代的稳定性。4.2结果4.2.1深度测序小RNA文库的特征通过本次试验，我们测得长度在35nt以下的小分子RNA序列20663443条，剔除低质量、污染和接头序列，总共获得高质量sRNA序列了18430387条。对长度分布统计可知，在18-24nt之间的sRNA占85.04%，长度为22nt的sRNA丰度最高。通过注释获得8636250条miRNA，占总sRNA的46.86%。与猕猴miRNA库进行比对，得到315种已知miRNA，其中丰度最高的是miR-21，占总读取数约27.43%。从测序结果中分析，仍然没有发现PRRSV自身编码的miRNA的迹象。图4.1小RNA文库中鉴定出的miRNA长度分布情况Fig.4.1LengthdistributionofmiRNAinthesmallRNAlibraries64 中国农业科学院博士学位论文第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索表4.3PRRSV感染后MARC-145细胞中最高表达量的miRNATable4.3MostfrequentlysequencedmiRNAsinPRRSV-infectedMARC-145cells.序号名称读取数序号名称读取数1mml-miR-21236962016mml-miR-378a625182mml-miR-140-3p53945817mml-miR-29a587903mml-miR-10347430918mml-miR-10a519534mml-miR-10733815919mml-miR-181a-5p422875mml-let-7e27919920mml-miR-125a-5p386766mml-miR-22119958721mml-miR-34c-5p343257mml-miR-30a-5p19494822mml-miR-192329528mml-let-7b17922523mml-miR-92a282239mml-miR-320a16860524mml-miR-423-5p2785710mml-miR-10113434425mml-miR-312463911mml-miR-1919968326mml-miR-23a2224312mml-miR-2229694427mml-miR-1851962113mml-let-7i8366228mml-miR-251139214mml-let-7a7167229mml-miR-931089615mml-miR-99b6940230mml-miR-2697894.2.2PRRSV感染前后miRNA表达的差异对315种已知miRNA进行差异表达分析，我们去除掉读取数极低的一些miRNA后，绘制了显著差异表达示意图。图4.2PRRSV感染前后表达差异最明显的miRNAFig.4.2DifferentiallyexpressedcellularmiRNAsinPRRSV-infectedMARC-145cells.65 中国农业科学院博士学位论文第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索4.2.3定位在病毒基因组的vsRNA分布在所有的读取结果中，有0.05%的序列基因组定位显示在PRRSV上，来自于正链和来自于负链的序列比为0.986，类似于miRNA序列长度，这0.05%的序列分布中最多的为22nt。把所有的vsRNA序列定位到PRRSV基因组上去，经分析发现，最热点的区域集中在ORF1a（nsp1、nsp2）及ORF1b（RdRp）上，读取数大概在200左右。4.2.4突变病毒N蛋白检测将系列突变体转染MARC-145细胞24h后，SR30A检测PRRSVN蛋白表达情况，可以看出，除p7USC-21-7e-t、p7USC-21-7e-1c、p7USC-21-t外，其它突变质粒都能检测到N蛋白的荧光。图4.3间接免疫荧光试验检测突变病毒N蛋白的表达Fig.4.3DetectionoftheNproteinsbyIFA4.2.5突变病毒生长曲线经上面IFA验证后，为了初步探索突变病毒的生长特征，我们每隔12h收取转染质粒后的上清，并对其复制增殖的动态进行了分析，用TCID50来表示。可以看出，P1代突变病毒被检测到的时间与亲本病毒和对照病毒有显著差异。v7USC-7e-t在转染早期检测不到病毒滴度，直至60h才出现，然而亲本病毒和对照病毒均在12h即可检测到，且在72-84h达到高峰。v7USC-7e-t滴度在各个时间点都明显低于亲本病毒和对照病毒，直至120h，其最高滴度比亲本要低100倍。v7USC-21-t、v7USC-21-7e-t和v7USC-21-7e-1c则在各个时间点，均没有检测到病毒，盲传三代后，也未拯救出活病毒。然而对插入序列随机进行3个点突变的v7USC-21-7e-3c也表现出类似5v7USC-7e-t的现象，即病毒检出的时间远远晚于对照毒，且最终的滴度仅达10左右。其它所有66 中国农业科学院博士学位论文第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索突变病毒与对照病毒的生长增殖特性都类似于亲本病毒。图4.4突变病毒和亲本病毒在MARC-145细胞上的生长曲线Fig.4.4GrowthkinecticsofvAPRRSandthemutantvirusesinMARC-145cells.4.2.6突变病毒遗传稳定性鉴于4.2.5中的结果，我们想知道突变病毒是否在细胞中维持了遗传稳定性，这是非常值得探讨的问题。为此，我们将P1、P3、P5代上清收取后经克隆送公司测序。结果显示，除v7USC-7e-t和v7USC-21-7e-3c外，其它所有病毒在P1、P3、P5代的所有10个克隆中，在插入位置都没有任何点突变，且随着病毒传代，其增殖速率也都与亲代病毒无明显差异，这说明插入拷贝数不高的miRNA结合位点（包括miR-199、miR-505、miR-26、miR-185），均不会对病毒造成有意义的危害，这主要可能是由于没有达到沉默下游基因所需要的有效拷贝数。然而，v7USC-7e-t和v7USC-21-7e-3c则从P1代开始，所挑取的10个克隆均出现多个点突变，主要出现在插入序列的3’端，会连续出现几个点突变。随着传代，有几株突变病毒则在竞争中获得优势并逐渐稳定，病毒的复制水平也逐渐恢复，不会再表现出转染第一代所呈现的抑制现象。然而有趣的是，所有挑取的克隆都只是通过点突变的方式逃避宿主内源miRNA的结合以获得生存，而没有发现将此段序列完全回复突变为亲本病毒的现象。这可能是由于病毒逃避miRNA总是倾向于采取更简便、更容易达成的方法。而对于插入细胞中拷贝数最大的miR-21的结合位点后，都无法拯救病毒，是致死性突变。这是因为miR-21作为细胞中最广泛的存在，对病毒造成的打击是致命的。总的说来，这些数据表明对PRRSV全长插入miRNA互补序列，虽然在转染后P1代可以显著抑制病毒的产生，但病毒可以通过发生点突变的方式，逃避miRNA结合。67 中国农业科学院博士学位论文第四章利用细胞内源miRNA影响PRRSV复制的初步探索4.3讨论本章节鉴定了PRRSV感染MARC-145细胞后miRNA表达谱，并进行了差异分析。结果可以看出，类似很多其它物种，miR-21也是MARC-145细胞中含量最丰富的miRNA（表4.3）。PRRSV感染后，可以对MARC-145内源的miRNA表达产生影响。已经确定了多种细胞miRNA，其表达在体外感染PRRSV发生显著改变，最显著的20种列于图4.2。其中很多miRNA在前人研究中与机体先天性免疫等息息相关。这表明，miRNA可能在PRRSV复制和宿主防御感染的网络中发挥着一些作用。与Parameswaran等在六种不同的RNA病毒和41种宿主细胞上的发现一致(Parameswaranetal.,2010)，我们发现在深度测序读取结果中，竟有0.05%的序列可以定位在PRRSV基因组上，这其中来自于正链和来自于负链的序列比接近为1，虽然这些vsRNA的丰度不高，生物学功能尚不清楚，但是我们相信最高超过200个拷贝的序列，在很多细胞编码的miRNA才检测到个位数的拷贝时，并不是偶发现象。我们把所有的vsRNA序列定位到PRRSV基因组上后发现，最热点的区域集中在ORF1a(nsp1,nsp2)及ORF1b(RdRp)上。而这些区域又恰好是与PRRSV调节宿主免疫及自身复制酶所在的关键区域重合(FangandSnijder,2010;MusicandGagnon,2010)，这两个现象的生物学联系还有待发掘。几类大的DNA病毒，特别是疱疹病毒，可以编码一套自己的miRNA(Cullen,2011a,b)。在RNA病毒中，还没有发现病毒自身天然编码的miRNA。这很可能是由于以下因素，包括基因组大小的限制，降解病毒基因组的潜在可能以及前体miRNA的加工难题等(tenOever,2013)。为确定PRRSV是否可以编码miRNA，我们根据小RNA深度测序的结果，分析了与PRRSV基因组相匹配的序列形成pre-miRNA发夹结构的可能性。然而，在PRRSV基因组序列范围内，我们没有找到任何潜在的miRNA茎环结构存在的证据。这表明PRRSV作为一种RNA病毒，仍然没有编码miRNA的迹象。当然，这只是一个时间点的测序结果，在其他时间点或有病毒编码的miRNA表达也不无可能。我们知道，当miRNA与靶基因序列完全互补配对时，会切割降解mRNA，起到基因沉默的作用；而当miRNA与靶基因序列不完全互补配对时，通常引起蛋白翻译的抑制(Bartel,2009;GuoandSteitz,2014)。虽然目前还没有RNA病毒有合成病毒miRNA的报道，但在绪论中已经谈到，可以通过改造RNA病毒来人工提供miRNA的靶点，提高内源miRNA的RNA干扰效率(Kelly,etal.,2010;Langlois,etal.,2012;Lee,etal.,2010;Pham,etal.,2012)。我们通过选取6条在MARC-145细胞中丰度不同的细胞miRNA，对这个假设进行了尝试。我们利用实验室的反向遗传平台改造病毒，使其包含与这6条miRNA互补结合的靶序列，结果发现，插入let-7e结合位点后，可以在转染后显著抑制病毒产生的时间和复制的速率，但遗憾的是突变病毒遗传不稳定。尽管如此，我们还是获得了一定试验数据，插入互补结合位点也不失为利用内源miRNA抑制PRRSV复制的一个研究思路，我们还可以进行更多的尝试，以寻找一株复制能力较弱且稳定遗传的PRRSV，用于抗病毒治疗的研究。总体而言，本章节研究发现，大量不同的miRNA在MARC-145细胞中表达，并且PRRSV感染会引起其中某些miRNA发生变化，利用细胞内源miRNA抑制PRRSV的策略还需要继续探究，这为我们未来研究miRNA在PRRSV感染中所扮演的角色提供了非常好的理论数据。68 中国农业科学院博士学位论文第五章全文结论第五章全文结论1.在15种候选miRNA中，我们发现仅有miR-26a具备抗PRRSV能力，可以显著抑制不同基因型和不同毒力的毒株在MARC-145细胞上的基因表达、蛋白翻译和病毒产出，且抑制作用的强弱与剂量呈正相关。2.miR-26可以抑制PRRSV在PAM细胞上的复制，且miR-26a作用明显强于miR-26b。种子区序列对于miR-26发挥抗PRRSV作用是必需的。3.miR-26a不能直接靶向PRRSV基因组RNA，而是通过上调I型干扰素及下游干扰素刺激因子发挥抗病毒作用。4.软件预测PRRSV5’末端第155-162位核苷酸与miR-130种子区完全互补配对，序列比对发现其在北美型中高度保守，而在欧洲型中不存在。5.miR-130家族均可以抑制PRRSV在MARC-145细胞和PAM细胞上的复制，且miR-130b作用最强，并与剂量呈正相关。6.miR-130b针对多株北美型PRRSV有效，却对欧洲型PRRSV无效，其作用靶标是位于北美型PRRSV5’端非翻译区155-162位的一段保守序列。7.体内试验证明对仔猪滴鼻给药miR-130b可以部分抵抗PRRSV感染，且血清中病毒载量显著低于攻毒对照组，提示其潜在的临床应用价值。8.利用深度测序结果分析PRRSV感染前后MARC-145细胞的miRNA表达谱，将细胞内源miRNA的靶序列插入全长感染性克隆3’UTR可以抑制PRRSV复制，但是拯救的突变病毒遗传不稳定，会在插入序列处发生多个点突变逃避内源miRNA的结合。69 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中国农业科学院博士学位论文致谢致谢上海，是梦开始的地方。五年的时光，在不经意间匆匆而去，却仿佛一切仍在昨天。回望来路，收获良多，有苦有乐，满怀感恩。最想感谢的人，是我的导师童光志研究员。在我硕博研究生期间，您用求真求实求新的科研态度，指导我完成博士论文的选题和研究。一次一次与您的交流，无论是科研上还是生活中，您严肃之余又不乏风趣，让我不仅看到一位科学家的正直严谨，更感受到慈父般的和蔼亲切。您对待学生，更是真诚无私，爱护有加。每当我遇到困难，您总是和善的谆谆教诲并给予帮助。向您致敬！致恩师袁世山研究员，是您将懵懂的我带到了这里，授我以知识，指导我前行，由衷地感谢您。致韦祖樟老师、高飞老师、姜一峰老师，特别感谢你们在实验上对我的悉心指导和倾囊相授，使得我可以顺利完成博士课题。感谢同一课题组周艳君老师、李国新老师、郑浩老师、单同领老师和童武老师给我的帮助和指导。感谢上海兽医研究所的各位老师，你们对我在所里的工作和生活，给予了热心的建议和关怀。感谢已经毕业的郑海红师姐、徐彦召师兄、王斌师兄、王亚欣师姐、张荣师兄、杨莘师兄在实验上的帮助，你们是我的榜样。感谢我的战友刘飞，三年来一起奋斗努力，愿未来一切顺利。致A417的小伙伴们，是你们的存在给我的每一天带来欢声笑语。深深的话儿，浅浅地说，在此祝福郑旭晨、孔宁、梁超、刘欢、李林、潘溪、夏天奇、王康、汪秀会、王鑫、田青、曲泽慧、宫晓倩、孟琼、阮宝阳、曹艳云，与你们相伴时光总是美好，心怀感激，唯有珍惜。致我的两位舍友，虞凌雪师姐和谢春师妹，我们一起分享生活上的心情和实验上的问题，你们的关心和照顾让我倍感温暖。感谢陈春燕师姐和张青占，刚来到上海，我们就成了朋友，一起度过很多美好的时光，现在各奔东西，愿你们幸福。致我的两位高中挚友范娜和许敏，曾经交换每个心情，如今联系不再算多，最想听到你们很好。感谢我的知己李佳，你用细心和耐心帮我排解苦闷，给我勇气，更陪我坚持至今。致我永远的朋友李聪，哭过笑过，都在心底。梦想在路上，愿在终点与你们重逢。感谢父母对我无私的爱与支持。你们的养育之恩，直到女儿27岁时才说一声报答。唯愿时光不走，感恩永远。紫竹的春天，有着梦中的色彩与香气，玉兰树下的阴影在幸福中摇曳。当你匆忙穿梭其中，她也许只是一个工作和学习的地方，可每当停下来，静静聆听，你会惊讶于她美的恬静，美的淡然。无声的岁月飘然去，心中的温情永不减。一路走走停停，终不忘继续前行。84 中国农业科学院博士学位论文作者简介作者简介一、基本情况姓名：李丽薇出生年月：1988年1月性别：女民族：汉籍贯：河南安阳政治面貌：中共党员二、学习经历2006.9-2010.6东北农业大学动物医学（本硕）专业攻读学士学位2010.9-2015.6中国农业科学院上海兽医研究所预防兽医学专业攻读博士学位三、博士期间发表文章与专利1.Li,L.,Wei,Z.,Zhou,Y.,Gao,F.,Jiang,Y.,Yu,L.,Zheng,H.,Tong,W.,Yang,S.,Zheng,H.,Shan,T.,Liu,F.,Xia,T.,Tong,G.HostmiR-26asuppressesreplicationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbyupregulatingtypeIinterferons.Virusresearch2015,195:86-94.2.Li,L.,Gao,F.,Jiang,Y.,Yu,L.,Zhou,Y.,Zheng,H.,Tong,W.,Yang,S.,Xia,T.,Qu,Z.,Tong,G.CelluarmiR-130binhibitsreplicationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinvitroandinvivo.underreview.3.Yu,L.,Zhou,Y.,Jiang,Y.,Tong,W.,Yang,S.,Gao,F.,Wang,K.,Li,L.,Xia,T.,Cheng,Q.,Tong,G.ConstructionandinvitroevaluationofarecombinantliveattenuatedPRRSVexpressingGM-CSF.Virologyjournal2014,11:201.4.Zheng,H.,Zhang,K.,Zhu,X.Q.,Liu,C.,Lu,J.,Gao,F.,Zhou,Y.,Zheng,H.,Lin,T.,Li,L.,Tong,G.,Wei,Z.,Yuan,S.Geneticmanipulationofatranscription-regulatingsequenceofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusrevealskeynucleotidesdeterminingitsactivity.Archivesofvirology2014,159:1927-1940.5.高飞，郑浩，姜一峰，李丽薇，郑海红，周艳君，韦祖樟，童光志.猪繁殖与呼吸综合征病毒5’非翻译区一顶端茎环结构是病毒复制转录必需的顺式作用元件.中国动物传染病学报[J]2014,22(4):7-166.虞凌雪，周艳君，姜一峰，童武，高飞，夏天奇，王康，杨莘，李丽薇，程群，童光志.表达猪源GM-CSF蛋白的重组PRRSV构建及鉴定.中国预防兽医学报[J]2014,36(4)7.程群，姜一峰，虞凌雪，王康，杨莘，李丽薇，高飞，于海，童武，童光志，周艳君.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒SHxx13/2013株的分离与鉴定.中国动物传染病学报[J]2014,22(2):32-388.姜一峰，周艳君，童武，虞凌雪，程群，杨莘，夏天奇，李丽薇，高飞，童光志.猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株最小免疫剂量的测定.中国动物传染病学报[J]2014,22(2):39-4585
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