抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）中药高效成分的体外筛选及其抗病毒机制的研究

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学位论文原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文，是在导师指导下，独立进行研究工作所取得的成果。騰文中已注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文研究做出过重要贡献的个人和集体，均已在文中ｋ乂明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。＞＇占曰作者签違（亲笔）：石蝴Ｗｔ年＾月｜戸学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定。即学位论文的知识产权属山西农业欠学；同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的原件、复印件和电子版；允许论文被查阅和借阅ｋ乂将入；本人授权山西农业大学可学位推文的全部或部分内容编有关数据库进行检索、＞〔，可＾乂采用影印、缩印或扭描等复制手段保存编学位论文。作者签違（亲笔）：；ｉ蝴妹年告月曰ｆｆ导师签杂（亲笔）：化年Ｍ／白日／＾）心＾１ 本研究由－１山西省科技攻关项目（Ｎｏ．２０１２０３１１０２２）国家高技术研究发展计划（８６３计划）课题（ＮＯ．２０１３ＡＡ１０１３０６）提供资助ＴｈｅｓｔｕｄｙｗａｓｓｕｏｒｔｅｄｂｒａｎｔｓｆｒｏｍｐｐｙｇＳｈａｎｘｉＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｓｓｕｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＮｏ－（．２０１２０３１１０２２１），細ｄ化ｅＮａｔｉｏｎａｌＨｉｇｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＰｒｏｇｒａｍｏｆＣｈｉｎａ巧６３Ｐｒｏｇｒａｍ）ＰｒｏｊｅｃｔＮｏ．２０１３ＡＡ１０２３０巧（ 目录摘要１３１ＰＲＲＳ述３概１．１ＰＲＲＳ的发现过程３１．２ＰＲＲＳＶ的分子结构和功能蛋白４１．３ＰＲＲＳＶ对细胞调它的诱导５２中药抗病毒的研究进展６２．１中药的抗病毒作用的研究现状６２．２具有抗ＰＲＲＳＶ作用的药物８３中药抗病毒作用机制８３．１中药的直接抗病毒作用９３．２中药的间接抗病毒作用１０前胃１２一ａｒｃ－１试验抗病毒药物筛选体系的建立及药物对Ｍ４５细胞安全性的影响１３１试验材料１３１１１３．试验用细胞及病毒来源１．２主要仪器１３１．３主要试剂及其配制１３２试验方法１４－２．１Ｍａｒｃ１４５细胞的培养１４２．２ＰＲＲＳＶ的扩增和收获１５２．３药物的细胞毒性测定１５３试验结果１６－３．１Ｍａｒｃ１４５细胞培养１＾１及攻毒结果１６３．２药物的细胞毒性测定结果１６４１７试验二ＰＲＲＳＶ对Ｍ－ａｒｃ１４５细胞感染性的测定１８１试验材料１８１．１试验用细胞及病毒来源１８１．２主要仪器１８１．３主要试剂及其配制１８２试验方法１９－ＰＣＲ２．１ＲＴ检测病毒对细胞的感染性１９■ ２．２细胞免疫化学测定病毒对细胞的感染性２２３试验结果２３３１－ＰＣＲ．ＲＴ检测病毒对细胞的感染性结果２３３．２免疫细胞化学测定病毒对细胞的感染性的结果２３４小结２５试验Ｈ免疫细胞化学法测定药物对ＰＲＲＳＶ感染细胞的抑制作用％１试验材料２６１．１试验用细胞、病毒Ｗ及药物来源２６１．２主要仪器２６１．３主要试剂及其配制２６２试验方法２６３试验结果２７４小结２８试验四药物对ＰＲＲＳＶ诱导的细胞调亡的影响２９１试验材料２９１．１试验用细胞、病毒Ｗ及药物来源２９１．２主要仪器２９１．３主要试剂及其配制２９２试验方＆２９３试验结果３０４３１分析与讨论３２１绿原酸、表告依春Ｗ及淫羊蕾巧抗ＰＲＲＳＶ作用分析３２２试验药物抑制ＰＲＲＳＶ诱导的细胞调亡作用分析巧３药物抑制ＰＲＲＳＶ的作用机制分析３４＾ｉｆｅ３６参考娥３７Ａｂｓｔｒａｃｔ４５ｍ＾４７ｇｔ％４９ 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）中药高效成分的体外備选及其抗病毒机制的妍究摘要目的：猪繁殖与呼吸综合征（ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ），又称为蓝耳病是一种传染性较强的常见猪病，病毒具有板易变异的特点，爆发后会，给养猪业造成板大的经济损失。目前针对该病主要采用注射疫苗进行预巧的手段可，Ｗ起到一定作用但尚没有针对ＰＲＲＳ的有效治巧方法。本试验选取从常见抗病毒中，草药金银花、板蓝根和淫羊蕾中提取的天然化合物绿原敵、表告依春和淫羊蓉普，ＷＭａｒｃ－１４５细胞为体外模型研究其是否具有体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用是，，否能够有效抑制由ＰＲＲＳＶ引起的细胞调亡，并初步探讨这些中药主要成分的抗病毒机制。ｋ方法：１通过采用细胞病变法（ｃｔｏａｔｈｏｌｏｉｃｅ报ｃｔＣＰＥ）乂及（）ｙｐｇ，嗟哇蓝比鱼法－－－－－－ＭＴＴ（３４５ｄｉｍｅｔｈｙｉｔｈｉａｚｏｌ２ｌ２５ｄｉｈｅｎｌｔｅｔｒ犯ｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）来测定中药提取物（，ｙ），ｐｙ，ａｒｃ－－在Ｍ１４５细胞体外模型上的最大安全浓度（ｍａｘｉｍｕｍｎｏｃｙｔｏ１；ｏｘｉｃｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＮＴＯｃＲＴ－ＰＣ民方法测定ＰＲＲＳＶ对Ｍａｒｃ－４５細胞的侵染通过免疫组化的口１作用）运用，－方法观察ＰＲＲＳＶ对Ｍａｒｃ１４５细胞的侵染部位并研究中药化合物在其安全浓度下对，病毒侵染Ｍａｒｃ－１４５细胞的抑制作用效果。３运用细胞调亡检测的方法研究中药化合物在其安全浓度下对ＰＲＲＳＶ诱导细胞（）调亡所起到的作用效果。结果：中药提取的天然化合物绿原酸、表告依春和淫羊蕾巧均具有抗ＰＲＲＳＶ的作用，Ｗ绿原酸最为明显。绿原酸的最大安全浓度为：５００帖／ｍ＾表告依春的最大安全浓度为：淫羊蓉普的最大安全浓度为．ＬｌＯＯＯ／ｍＬ：３１２５ｉ／ｍ。ｎｇ，＾ｇ在最大安全浓度－下添加绿原酸和表告依春ａｒｃ１４５细胞ＰＲＲＳＶ的侵，可Ｗ使得Ｍ免受染同时细胞的，调古数量明显低于未添加药物的病毒对照组而淫羊霍普不能完全防止ＰＲＲＳＶ侵染，一Ｍａｒｃ－１４５细胞但可Ｗ减少受病毒侵染的细胞数目定抑制细胞调亡的作用。，并起到，结论：中药提取的天然化合物绿原酸、表告依春具有较强的体外抗ＰＲＲＳＶ的作用，而淫羊霍普的体外抗ＰＲＲＳＶ的作用并不理想，推测绿原酸与表告依春的抗病毒机制可能是直接灭活ＰＲＲＳＶ并抑制由ＰＲＲＳＶ引起的细胞调亡来实现而淫，羊霍每则－－１ 一可レ乂定程度的抑制由ＰＲＲＳＶ引起的细胞调亡。．关键词：猪繁殖与呼吸综合征．细胞调亡；綠原酸表告依春淫羊蓉普；－２－ 文献综述猪繁殖与呼吸综合征病毒（ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ）主要感染和损伤巨隧细胞，导致机体免疫力降低，并引起继发感染，可Ｗ给养猪业造成严重威胁和重大的经济损失，有较大的防治难度。目前该病主要依赖注射ＰＲＲＳＶ疫苗对其进行预防，但尚无针对的特效抗病毒药物，且使用合成的抗病毒西药则易产生毒副作用一，对机体正常细胞造成定影响。目前国内外已有大量的关于中药抗病毒的相关研究一，中药抗病毒是个新的研究方向，利用中药治巧蓝耳病有重要意义一。通过中药抗病毒这个新兴热点研究中药抗病毒作用，可Ｗ为蓝耳病的治疗提一供个新方向。１ＰＲＲＳ概述１１Ｐ．ＲＲＳ的发现过程ｎｄ一猪繁殖与呼吸综合征（ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｓｙｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）是种常见猪病，又称为藍耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄ一ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ）所引起的种由接触传播的急性疾病，具有高度的。、传染性得病后，其主要的临床表现为怀孕母猪发生流产早产Ｗ及产死胎等繁殖方＞面的功能障碍１。，＾１及仔猪与育肥期的猪呼吸困难等呼吸系统症状被世界动物卫生组（Ｏｆｉｃｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｄｅｓｅｉｚｏｏｔｉｃｓ０圧）列为Ｓ《织，ｐ，类疾病中华人民共和国动物防》一疫法将高致病性猪繁殖与呼吸综合征列为类动物疫病。近年来，高致病性藍耳病。不断的爆发，给世界的养猪业造成了极大的经济损失美国在１９８７年首先报道了北卡罗来纳州蓝耳病的发生，随后在德国（１９９０年１１月）、荷兰（１９９１年１月）、比利时（１９９１年３月）、加拿大等养猪业发达的欧洲国家ｔＷＷ也陆续暴发了该病。而在１９９１年的年巧，我国台湾地区也出现了藍耳病。在１９９６＂年。然而最初，人们并不能确定该病的病因，故称其猪神，中国大陆也出现此猪病＂＂＂秘病（Ｍｙｓｔｅｒｙｓｗｉｎｅ出ｓｅａｓｅ），或因其耳周发蓝称其猪蓝耳病（Ｂｌｕｅｅａｒｄｉｓｅａｓｅ），＂＂或猪不育和呼吸道综合征（Ｓｗｉｎｅｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｙｓｎｄｒｏｍｅ，ＳＩＲＳ）等。１９９１ｐｙ一年，名叫做＼￥６１１８＾０１１博±荷兰科学家，对受感染猪的肺巨隨细胞培养并首次分离Ｗ到Ｌｅｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓ，作为欧洲株型代表。１９９２年美国学者Ｃｏｌｌｉｎｓ也从本国的病猪体内Ｗ。分离到相类似的病毒，作为美洲株型代表经过对这种病毒的形态结构Ｗ及抗原性一＂等方面的研究一猪，证明这是种新发现的病毒。１９９２年，欧共体将此病统命名为－３－ Ｗ＂繁殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）。１９９６年，我国农业科学院哈尔滨兽医研究所的郭宝＾清等人首次从国内的疑似ＰＲＲＳ病例中分离出ＰＲＲＳＶ，与美洲型十分的相类似。并且，我国于２００６年爆发高致病性藍耳病，其波及范围之广是完全没有预料到的。１２ＰＲＲＳＶ的．分子结构和功能蛋白猪繁殖与呼吸综合征病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｐｐｙｙ，一ＰＲＲＳＶ￣）的病毒粒５０子为球形，直径大约为６５ｎｍ，病毒粒子外绕有脂质双层膜，囊膜的表面有比较明显的纤突？，其核衣壳呈立方形，其直径为３０３５ｎｍ，属于有囊膜的单股正链ＲＮＡ病毒，在病毒分类中属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，其基因纪全＂＂长约为５化５＇一３’１，在非编码区前有个帽子结构，端非编码区后有多聚腺巧酸ｉｇ－ｉ２ｏ［］ｐｌｙＡ。病毒基因组共含有９个开放阅读框ｅｎｒｅａｄｉｎｆｒａｍｅｓ，ＯＲＦｓ，（解构（邱ｇ）分别是ＯＲＦｌａ，ＯＲＦ化，ＯＲＦ２ａ，ＯＲＦ２ｂ，＂及ＯＲＦ３，ＯＲＦ４，ＯＲＦ５，ＯＲＦ６，ＯＲＦ７，并且相邻阅读框互有重叠。其中ＯＲＦｌａ和ＯＲＦ化的功能是编码病毒的非结构蛋白，ａ？而ＯＲＦ２、ＯＲＦ２ｂＷ及ＯＲＦ３ＯＲＦ７可Ｗ编码病毒的结构蛋白。ＰＲＲＳ病毒基因组中的ＯＲＦ１序列的功能是编码非结构蛋白的ＲＮＡ聚合酶，基因组中的另外序列ＯＲＦ２ａ，ＯＲＦ２ｂ，ＯＲＦ３，ＯＲＦ４，ＯＲＦ５，ＯＲＦ６，ＯＲＦ７等也编码７种结构蛋白，这４：种结构蛋白分别是为ＧＰ２ａ、ＧＰ２ｂ、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ５蛋白Ｗ及Ｍ蛋白和Ｎ蛋白。其中，ＧＰ５蛋白、Ｎ蛋白Ｗ及Ｍ蛋白为病毒的主要结构蛋白，因此含量较多；其余四种结构蛋白含量相对较少，为病毒的次要结构蛋白。其中ＧＰ２ａ、ＧＰ２ｂ、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ５均为糖基化蛋白，而Ｍ蛋白与Ｎ蛋白均为非糖基化蛋白。其中，Ｍ蛋白在所有类型的ＰＲＲＳＶ毒株中是最保守的蛋白，同时，Ｎ蛋白的含量明显高于病毒中的其他结构蛋白成分。开放阅读框ＯＲＦ１，包括ＯＲＦｌａ化及ＯＲＦ化，编码与病毒ＲＮＡ复制和转录的有关的蛋白，由基因组ＲＮＡ直接表达。ＯＲＦｌａ的作用是编码ｐｐｌａ多聚蛋白，ＯＲＦ化的作用是编码ＰＰ化多聚蛋白。位于ＯＲＦ１区的，这两种蛋白被自身病毒蛋白酶水解而产２生的Ｎｓｐ基因编码的蛋白属非结构蛋白，推测可能与ＰＲＲＳＶ的嗜细胞性Ｗ及嗜组ｉｗｓｔｉ织性有关。其中ＯＲＦ５编码的糖蛋白ＧＰ５是病毒主要的保护性抗原，ＧＰ５是唯一的糖基化的主要结构蛋白，可Ｗ诱导细胞调亡并且参与ＰＲＲＳ病毒粒子与受体的结６－ＷＵＰＲＲＳＶ一合。由于的易突变，各国学者直关法ＰＲＲＳ病毒基因的易变性Ｗ及其ｔＷＵＰＲＲＳＶ分子进化机制。整个基因组均可发生变异，但尤其ＷＮｓｐ２基因和ＯＲＦ５ＰＲＲＳＶ－基因变异最大。例如，美国分离株ＭＮ１８４和我国分离株ＨＢ２相比较而言，３’２２Ｎ２Ｕ３其差别就在于ｓｐ均缺失数量不等的氨基酸。同时，不同的ＰＲＲＳＶ分离株中，－４－ ｎｗ３２４邸，］５氨基酸序列中存在数量不等的点突变。因此，国内外学者多１＾０ＲＦ５基因Ｐ１ＷＷＰＲＲＳＶ为依据，来绘制的系统发育树。１．３ＰＲＲＳＶ对细胞调亡的诱导１．３．１细胞调亡的概念细胞调亡（Ａｏｔｏｓｉｓ）的概念最早是在１９７２年由澳大利亚昆：ｔ兰大学的Ｋｅｒｒｐｐ教授根据形态学特征首先提出的，是指由于内外环境发生了变化或细胞死亡信号被触发Ｗ及在基因调控下所引起的细胞主动死ｔ过程细胞调亡过程大致上可被分成Ｈ个阶段：起始期、整合期和执行期。起始期是指细胞通过不同的信号途轻，接收到外一界的多种与调亡有关的信号，细；整合期指细胞接受到的多种起始信号整合在起胞一旦作出死亡的决定一作出是否启动调亡的决定；执行期是指细胞，即进入个不可逆ＰＳ１的过程。细胞调亡有内部途径与外部途径两种，但是两种途径都是由天冬氨酸蛋白。ＤＮＡ水解酶介导外部途径又称为由死亡受体介导的细胞调亡途径，内部途径是由于发生损伤，或者细胞遭受福射或者受到病毒感染等原因引起。１．３．２巧毒引起的细胞调ｔ可诱导细胞发生调亡的因素有很多如温度、酸碱度和激素水平的变化或者细胞一收到嬌射等。目前，病毒感染也是种千分常见的可Ｗ诱导细胞发生调亡的重要因素已有大量资料表明，病毒对细胞的感染与其调亡有十分密切的关系，病毒引起细胞调亡的原因是相对复杂的一。病毒对细胞的感染，主要有两种方式，种是病毒复制Ｗ及病毒ＲＮＡ指导下的蛋白表达对细胞产生毒性作用一；另种是病毒抑制了细胞自身正常的核酸与蛋白质代谢功能。目前的研究，但这两种作用效果最终都会导致细胞病变表明，许多病毒对细胞产生的病变效应的方式是通过诱发细胞调亡来实现的，细胞调亡在病毒感染机体并致其发病方面具有十分重要的意义。当细胞遭受病毒感染后，病一些蛋白来主动诱导细胞发生调亡毒会编码，因为在细胞发生涧亡时，病毒粒子会被包裹到调亡细胞产生的调亡小体中，这样，细胞发生调亡过程中就会释放病毒粒子，并且在这一过程中，病毒能够很大程度上避免机体炎症反应对自身造成伤害，这对于Ｐ９＾病毒的扩散是具有积极作用的。１．３．３ＰＲＲＳＶ引起的细胞调亡目前，已有文献报道称，ＰＲＲＳ病毒的两个基因型（美洲型与欧洲型）均能在体Ｐ０－３＾内外诱导细胞发生润ｔ：。ＰＲＲＳＶ所诱导的细胞调亡在化体内的各种組织及细胞中均有发现，常见于肺部、肺口淋己结、扁桃体、脾脏、也脏、支气管淋己结、睾丸姐织等，同化引起肺部巨隨细胞、淋己细胞化及生殖细胞的调己这说明，由ＰＲＲＳＶ－５－ 诱导所产生的细胞调亡可能是一ＰＲＲＳ种常见现象。已有研究称，被病毒感染的细胞其数量可能会少于被其诱导产生渦亡的细胞，因此，ＰＲＲＳＹ诱导所产生的细胞调ｔ可一能是通过种间接机制而产生的。有研究表明，，ＰＲＲＳＹ诱导所产生的调亡在细胞被ＰＲＲＳ病毒感染后的第１天就可Ｗ被检测到，并且在被感染后的第５天就会达到高峰期，而在病毒感染后的第７天却只有少量调亡细胞被检测出，且病毒感染和被其诱导的细胞调亡，在细胞水平上不能同时被定位，这说明病毒感染与由其引起的细胞调亡不是同时发生。由此推测感染ＰＲＲＳＶ的猪，其肺泡巨隨细胞大量减少，原因可能是ＰＲＲＳ病毒诱导宿主巨瞻细胞的调亡所导致。现已明确，ＰＲ民ＳＶ所引起的细胞调ｔ作ＰＳ１５用与病毒的ＧＰ蛋白有关。有人做过的缺失突变质粒的体外瞬时表达的试验，结果表明，ＰＲＲＳＶ的ＧＰ５蛋白Ｎ端的１１８个氨基酸对于保持ＧＰ５蛋白诱导细胞调亡的活性是必不可少的Ｃ端却不会影响病毒诱导细胞调亡的活性。ＳｕａｒｅｚＰ，而缺失一等通过对Ｂｃ－２种可持久大量表达ｌ蛋白的细胞系研究发现，可ｔｉｌ在死亡受体途径和ｃ－２ＰＲＲＳＶ线粒体途径起到抑制细胞调亡作用的膜整合蛋白（Ｂｌ），并不能抑制所诱３９［１导产生的调亡。由此推测，ＰＲＲＳＶ所引起的细胞调亡可能是通过其他途径诱导细＾Ｗ－胞发生澗亡，或者由ＧＰ５蛋白引起的细胞调亡作用在Ｂｃｌ２的下游。此外，Ｃｈｏｉ等－－研究发现，可引起ａ肿瘤坏死因子（ＴＮＦａ）在肺部组织的高，个体感染ＰＲＲＳＶ后一ＴＮＦ－表运。ａ是种具有杀伤肿瘤细胞作用的细胞因子，与细胞调ｔ之间有十分密切的关系，在许多由病毒诱导所产生的细胞调亡中起着重要作用。这说明巨晦细胞释放的ＴＮＦ－ａ可能是诱导其周围未遭受病毒感染的发生调亡的主要因素。这说明ＰＲＲＳＶＴＮＦ－ａ的大量表达有关所引起的细胞涧亡与。２中巧抗病毒的研究进展近几年一些，国内外的众多研究者已从中国的传统中草药中不断的筛选和寻找出具有抗病毒作用的药物，其中已有不少已经被开发并应用于临床。随着提取技术Ｗ及研究手段的不断发展，中草药抗病毒的研究必将愈加深入、全面，所涉及到的中药种类更加广泛，送对未来生产具有抗病毒作用的中药制剂有着十分重要的意义。２．１中药的抗病毒作用的研究现状４２ｗ’３目前已有研究证实，多种中草药都具有非常强的抗病毒作用和效果，而且其作用形式多样，单味中药，中药复方Ｗ及中药提取物等均已被证实具有抗病毒作用。２．１．１具有抗病毒作用的单味中药在临床上用于治疗病毒性疾病的单味中药种类繁多。巧药中的提取物ＣＹ对由于－６－ 单纯疮疹病毒－１（ＨＳＶ）感染所引起的皮肤损伤有良好的治疗作用人参对柯萨奇Ｂ３ＨＳＶ－１病毒的复制有明显抑制作用病毒Ｗ及，同时对细胞免受病毒感染有很强的＾１＾保护作用。黄馬的水煎液对流感病毒科及水疮型口炎病毒（ＶＳＶ）等能够起到定的抑制作用并且还有研究认为，可Ｗ通过提高机体，黄谋具有抗流感病毒的作用生成干扰素的能力从而在一定程度上能够抑制病毒繁殖。金银花对小鼠流感病毒性，肺炎有明显抑制作用并且连翅的提取物具有抗柯萨奇Ｂ３Ｙ、柯萨奇Ｂ５Ｗ及埃可（ＥＣＨ１９Ｖ）病毒的作用。还有研究称，野菊花也表现了较强的抗流感病毒的作用。２丄２具有抗病毒作用的中药提取物目前许多中草药中的具有抗病毒作用的成分也已经得到确认，并且得到较纯提取物大黄醇提液在体外的细胞模型上表现出了明显抗病毒作用－１，可Ｗ对ＨＳＶ的ＳＷＩ感染起到预防作用，并且可Ｗ直接杀死病毒颗粒。甘草甜素已经被证实具有广泛的抗病毒作用。梁再赋等在培养的ＲＫ细胞（兔肾细胞）上研究发现，甘草甜素不但具ｔＷ有直接灭活病毒的作用，也可Ｗ抑制细胞内乙型肝炎病毒的增殖。茶色素的初级氧化产物茶黄素灯巧＾及其单体其没食子酸醋，对艾滋病毒的逆转录酶Ｗ及体内各种细Ｗ１胞的ＤＮＡ和ＲＮＡ聚合酶活性均具有明显的抑制作用。黄岑素可对艾滋病病毒的感染起到抑制作用，能诱导感染ＨＩＶ的细胞调亡甘草多糖具有明显的抑制单纯疮疹病毒Ｉ型、腺病毒３型、疮疹性口炎病毒Ｗ及牛痘病毒等活性，能显著改善细５３ｍｖｆ］，，胞病变使机体细胞得到保护甘草皂昔能破坏病毒培养物中的，有人认为甘草皂巧可Ｗ通过恢复Ｔ细胞的増殖从而对病毒起到抑制作用。２丄３具有抗病毒作用的中药复方目前，许多中药复方证实也已经被证实具有抗病毒作用。由金银花、连翅、黄岑５４］［Ｖ－－－－１ＨＳＶ２ＣＢＶ３ＢＶ４Ａ３Ｖ、民ＳＶ、组成的双黄连粉针剂，具有明显抗ＨＳ、、、Ｃ、ＡＤＶ－３－ＭＶ１３Ｗ及新型肠道病毒７型病毒的作用，同时、），对ＰｏｌｉｏＶ麻疹病毒（ＷＶＳＶ一及水泡性口炎病毒（）等也有定的抑制作用。由板蓝根、虎杖、红条紫草、茵ｓｓｔｉ陈－２病毒、苍术组成的抗病毒胶囊ＨＳＶ，，本方的药物可Ｗ与相互作用使得病毒颗粒的形态发生明显改变，病毒颗粒变形且大小不均，在药物作用下出现了病毒包膜裸露或破损，病毒颗粒凝集融合成块状，病毒结构变得结构模糊不清等现象，说明此中药复方在体外可破坏ＨＳＶ－２病毒颗粒的形状结构、表面成分和分散度。由金银花、鱼腥草、大青叶、蒲公英等药味组成的中药复方，经体外实验研究发现，对人巨细胞病毒化ＣＭＶ）的增殖有明显的抑制作化抑制由ＨＣＭＶ所致细胞病变，使血清中－ａ－２－的肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）和白细胞介素（正巧恢复正常水平。已有研究表明，由板ｗｉｆ－ＡＤＶ－３可Ｗ对ＨＳＶＩ藍根、蕾香、甘草、贯众、金银花等１０味药组成的中药复方，和－７－ 起到明显的抑制作用。２．２具有抗ＰＲＲＳＶ作用的药物已有文献报道由虎杖、黄茂、景天Ｈ屯、半枝莲、词子等１０味中药组成的中药复方提取物具有抗ＰＲ民ＳＶ的作用。孙娜等通过体外采取ＭＴＴ法与细胞病变法试验证二ＰＲＲＳＶＲＲＳＶＭ－１４５明甘草酸钟具有抗的作用，甘草酸二钟可Ｗ有效的抑制Ｐ在ａｒｃ细胞上的复制，也可起到将ＰＲＲＳＶ直接灭活的作用赵昕等发现提取自中药苦参Ｐ９］的苦参碱也可Ｗ对ＰＲＲＳＶ起到明显的抑制作用。Ｋａｒｕｐｐａｎｎａｎ等采用间接免疫巧－光的方法证明哇己因１２－１３－－２０－、鄉氨霉素、去氧大戟醇苯己酸醋酸醋Ｗ及赡驗灵均－胃能够有效的在Ｍａｒｃ１４５细胞上抑制ＰＲＲＳＶ的复制。Ｋｉｍ和Ｌｅｅ等研究发现利己韦林能够在体外抑制ＰＲＲＳＶ的复制，推测利己韦林可能是通过抑制宿主的次黄嘿吟核昔酸脱氨酶的活性，导致宿主细胞内的ＧＴＰ的消耗，从而影响病毒ＲＮＡ的合成，进ｔＷＰＲＲＳＶＬＰＲＲＳＶ而抑制的复制ｑｉｕ等研究发现牛膝多糖和硫酸化牛膝多糖都可Ｗ对的复制起到抑制作用，但是硫酸化修饰的硫酸化牛膝多糖能够在更低的浓度下起到抑制ＰＲＲＳＶ复制的作用Ｙａｎｇ等通过实验证明来源于鱗毛藤贯众的黄绵马酸ＡＢ具有体外抗ＰＲＲＳＶ的作用，，并且能够抑制ＰＲＲＳＶ的内在化，干扰其在细胞间的扩散ｔＷ推测黄绵马酸ＡＢ是通过诱导宿主细胞产生抗病毒因子來抑制ＰＲＲＳＶ的复制。另６６７［Ｗ５６６】［］［］［ＩＩ－－己醜青霉胺有文献报道Ｉ型干扰素、Ｉ型干扰素、替米考星、正１２Ｗ及Ｎ均具对ＰＲＲＳＶ有抑制作用。除了中药及其提取物＾外，小干扰ＲＮＡ可１＾通过抑制ＰＲＲＳＶ的Ｎ蛋白的合成来ｔＭｌ抑制ＰＲＲＳＶ的复制，重组腺病毒介导的短发卡ＲＮＡｓ可Ｗ通过在ｍＲＮＡ水平抑制６９ＰＲＲＳＶＲＦ化［］的Ｏ基因的表达来抑制ＰＲＲＳＶ复制，富含高浓度次氯酸的微酸性的７ＰＲＲＳＶ起［Ｗ电解水可对到直接的杀伤作用。３中药抗病毒作用机制中药的作用效果包括法邪与扶正两方面一，方面对入侵机体的病原体起到直接杀一伤作用，另方面提高机体的免疫功能，从而増强机体的抗病能力，对抵抗病毒侵入起到间接作用。病毒的増殖过程包括对宿主细胞的吸附、侵入、脱壳、病毒基因组复制、病毒蛋白的合成、病毒的组装与释放等。药物对病毒的直接抑制作用是针对病毒一在宿主细胞内的复制过程中的某个或者多个步骤进行干预，从而，抑制病毒的増殖一步侵入阻断病毒对机体的进。同时，病毒对宿主细胞的感染势必会引起机体的免疫反应，因此许多病毒产生了免疫逃避机制，从而避免机体免疫系统对其造成损伤。増－８－ 强机体的免疫能力也可ｗ对抵抗病毒侵入起到间接作用。３．１中药的直接抗病毒作用按照病毒在宿主细胞内的复制增殖过程，中草药直接抗病毒作用有下的几种方式：直接对病毒起到杀伤作用、狙止病毒对宿主细胞的吸附与侵入、抑制病毒遗传物质的复制Ｗ及抑制病毒的组装与释放。３丄１中药对病毒的直接杀伤作用王志玉研究发现。李铁民经，大黄醇提液中的息酿类物质对病毒有直接杀灭作用ｆＷ过研究发现。，提取自甘草的甘草甜素可Ｗ对带状疮疹病毒起到直接杀灭作用张其ｎｔｉ威等报道称。已有研究表明，，板藍根可Ｗ对疮疹病毒起到杀灭作用而非抑制作用鱼腥草中含有的挥发油可Ｗ破坏流感病毒的囊膜结构，直接杀伤流感病毒。Ｇｒａｖｉｎａ等研究发现桑色素可Ｗ直接在体外杀灭马属动物疮疹病毒Ｗａｎｇ等通过体外试验ｆＷ发现甘草提取物甘草酸在体外有杀灭科萨奇病毒Ａ１６的作用。３丄２中药对病毒吸附与侵入的抑制阻止病毒对宿主细胞的吸附与侵入也是抑制病毒増殖的重要步骤。中药成分中的黄爾类、Ｈ萌类化合物、多糖及其衍生物等都具有抑制病毒吸附的作用。有研究表明，红花中提取的多酪类物质可Ｗ有效抑制流感病毒对宿主细胞的吸附。ＫＭ等研究发现，草豆疆的提取物可Ｗ通过与轮状病毒表面的血红细胞凝集素蛋白发生相互作用，Ｐｓｉ从而阻止病毒对宿主细胞的吸附。Ｙｅｈ等发现肉担提取物可Ｗ抑制人呼吸道合胞病ｎ、毒对宿主细胞的吸附作用Ｓｏｇ等通过免疫巧光试验ｑＰＣＲ手段，通过透射电镜观察到硫酸化后的川明参多糖可Ｗ明显的抑制鸭病毒性肠炎，其作用机理就是阻止病７＾毒对宿主细胞的吸附１＾。３丄３中药对病毒逸传物质复制的抑制抑制病毒遗传物质在宿主细胞内的复制合成也是中药直接抗病毒作用的一个重要ｔＷ手段。硫酸半孰聚糖可通过抑制单纯疮疹病毒逆转录酶的活巧，达到抗病毒作用。苦瓜中的苦瓜素可Ｗ明湿抑制柯萨奇Ｂ３病毒在宿主细胞中的ＲＮＡ复制过程。Ｗａｎｇ等通过体外试验发现甘草提取物甘草酸能够抑制肠病毒７１的基因组在细胞内的７９［１复制。Ｓｏｎｇ和Ｃｈｏｉ采用巧ＣＲ的方法检测提取到的飞水萄素对流感病毒的ｍＲＮＡｔｗｉ的影响时发现，飞水药素可Ｗ有效抑制流感病毒ｍＲＮＡ的表达。３．１．４中药对病毒组装与释放的抑制一病毒的组装与释放是病毒复制的最后一个步骤阶段对其进，也有药物能够在这ｔＷ行阻断。目前已有研究表明，裂搁茵多糖可Ｗ有效抑制仙台病毒在细胞间的扩散。－９－ 有实验表明，甘草甜素可在体外有效抑制ｖｓｖ病毒从感染细胞向未感染细胞扩散。Ｌｉｎ等经研究发现，南瓜子碱、京尼平、奎尼酸、紫下香酸Ｗ及花椒碱等中药提取物能够对流感病毒的Ｍ２离子通道进行阻断，使得病毒不能顺利释放到细胞外，从而起到对流感病毒的抑制作用病毒依靠细胞调亡完成病毒粒子的释放，张春晶等研究ｃａｓａｓｅ－８－３发现，ｃａｓａｓｅ，，黄萃巧可ｔＵ通过抑制ｐ的激活从而抑制ｐ的活化Ｗ此降低流感病毒对细胞调亡的诱导作用，从而阻断病毒的释放过程３．２中药的间接抗病毒作用中药抗病毒作用的间接途径主要是指中药可Ｗ通过增强机体的免疫功能，从而提高机体免疫力，进而达到抗病毒作用。中药的间接抗病毒作用在中药抗病毒的研究中８４’８５ｔ３具有十分重要的意义，也是中药起到的抗病毒效果有别于其他合成药物的标志。３１．２．中药对免疫器官与免疫细胞的调节有研究发现中药提取物能过促进机体免疫器官发育，，并且增强免疫细胞活性如蒲公英提取物可Ｗ増强小鼠脾脏淋臣细胞的増殖能力及巨瞻细胞的吞懂指数水平。、目前也有文献报道称，金银花青嵩、黄连等中药能够提高免疫细胞对入侵病毒的吞，小柴胡汤在机体的细胞免疫處作用。孙巧等人研究发现、体液免疫及巨嗟细胞的吞懂功能方面均有显著的増强作用张乐翠等经研究发现，黄读多糖与香茹多糖均能够促进胸腺和贿脏等免疫器官的发育。３２２中药对干扰素．．的诱生作用，众所周知，干扰素（ＩＦＮ）具有广谱抗病毒的作用它能够诱导机体产生抗病毒蛋白Ｗ此方式來阻断病毒的产生，因此可阻止病毒増殖和扩散。已有研究表明，中药可Ｗ促进并诱导机体的干扰素生成，从而提高机体的免疫力。已有报道称，提取自香茹中的香茹素，能诱导血清中ＩＦＮ的生成。青窩素、丹参、刺五加和龙胆草等中药－也均具有诱导干扰素生成的作用，从而起到抗病毒作用。Ｊｉａｎｇ等研究体内抗ＨＩＶ１三种具有抗氧化作用的化合物－２，其中两种小分子化合物Ｌ２Ｆ时，从荷花的根中提取到一－正－心和Ｌ２Ｆ３，研究发现其可Ｗ上调２的表达量，下调１０的表达量，另种化合物１－正－－－１２４１０１＾２？２１＾２可３２可＾提高比、１＾及正的表达量，１＾１通过直接下。并且和ＴＮＦ－ａＨＩＶ－调的表达量从而抑制１有研究报道，大青叶能促进被刀豆蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）Ｔ细正－２ＴＢ活化的胞分泌，并且能够对ｃ细胞与细胞的分化Ｗ及増殖起到促进作用，从而对机体的细胞免疫和体液免疫功能起到调节作用。一利用中药治疗由病毒感染引起的疾病，不是像化学合成药物样仅对病毒产生直、接杀伤作用，而是注重病毒机体与中药Ｈ者之间的关系。中药不仅能够直接杀灭病－－１０ 毒，还可ｗ在病毒的吸附、穿入、复制、装配与释放等多个环节起抑制作用，并且更重要的是増强并调动机体的一，中药还能够对机体免疫力进行调节切免疫防御功能，，使其发挥抗病毒作用。中药能够多途径、多环节的改善因病毒入侵所造成的机体的不良反应和症状，是利用中药抗病毒所具有的独特优势。－－１１ 前言猪繁殖与呼吸综合征自２０世纪８０年代出现后，在北美洲、欧洲Ｗ及亚洲相继流行并爆发，给全球的养猪业造成了极大的经济上的损失。目前，此病只能依靠注射疫苗来预防其发生，但注射疫苗具有Ｈ方面不足：首先，ＰＲＲＳＶ由于是单链ＲＮＡ病毒，具有易变异的特性，对于变异的ＰＲＲＳＶ来说，疫苗注射并不能起到作用；其次，注射弱毒苗有时无法引起个体内产生抗体，起不到预防作用，或者疫苗在体内发生改变反而引起机体发病；另外，蓝耳病目前呈现小范围发病的特点，大批量注射疫苗会造成养殖成本的増加。目前，在蓝耳病发病期间，尚没有有效的治疗方法Ｗ及药物。因此广大的养殖户对于寻求治疗猪繁殖与呼吸综合征的有效药物，有着迫切需求。此前早已有报道可Ｗ从植物中提取具有抗病毒作用的有效成分，在近几年得到广泛的关注。我国使用中药进行疾病治疗己有数千年历史，其中不乏具有抗病毒作用的中药种类。但传统的中药治疗方法有其不可忽视的弊端，例如中药治疗疾病起到了治一一疗效果，却不知其中起作用的具体成分是哪种或类；如不同批次的中药本身含有的有效成分含量不同，可能造成治疗效果不同。目前，已有大量的文献报道从传统中ｗｗｔｉ一。药提取到具有抗病毒作用的活性成分，其中有些对ＰＲＲＳＶ有明显抑制作用－ａｒｕａｉｍａｎ去氧大戟醇－－－－Ｋｐｐ等证明唾己因、缴氨霉素、１２１３苯己酸２０醋酸醋Ｗ及赡驗ｒｃ－１４５细胞上抑制ＰＲＲＳＶ的复制ＫＬｅ灵均能够有效的在Ｍａｉｍ和ｅ等研究发现利ｔＷ己韦林能够在体外抑制ＰＲＲＳＶ的复制。Ｌｉｕ等研究发现牛膝多糖和硫酸化牛膝多糖都可Ｗ对ＰＲＲＳＶ的复制起到抑制作用另外，小干扰ＲＮＡ可Ｗ通过抑制ＰＲＲＳＶ的Ｎ蛋白的合成来抑制ＰＲＲＳＶ的复制本试验选取了３种已经被证明具有抗病毒作用的传统中药：金银花，板蓝根和淫羊蕾Ｍ－，使用其提取物的主要组成成分绿原酸ａｒｃ１４５，表告依春Ｗ及淫羊蕾巧，在细胞模型上进行试验。目前，已有研究表明绿原酸与表告依春具有抗病毒作用，而淫羊蕾巧则有研究表示其具有抗细胞调亡的效果。因体外筛选具有时效短、见效快的特点一ＰＲＲＳＶ，故而建立个体外细胞模型来测定Ｈ种中药提取物是否具有抗作用，Ｗ及对一定的抑制作化并初步阐述Ｈ种药物的抗病ＰＲＲＳＶ弓鳩的细胞调亡能否起到毒机制，为治疗由ＰＲＲＳＶ引起的猪繁殖与呼吸综合征寻求新方法。－－１２ 一试验抗病毒药物筛选体系的建立及药物对Ｍａｒｃ－１４５细胞安全性的影响ｒｃ－４５、。本试验首先对Ｍａ１细胞进行复苏传代Ｗ及冻存并对所购的病毒活苗进行－４５。ｒｃ１扩増和收获，Ｗ便后续试验使用本试验旨在测定所选药物对Ｍａ细胞的最大安全浓度，从而在测定病毒对细胞的侵染所导致的细胞病变时，排除是所添加的药物对。细胞的损伤，使得所得结果真实可信１试验材料１．１试验用细胞及病毒来源一－１ａｒｃ４５细胞，本试验所用细胞为Ｍ，来源于非洲绿猴肾细胞，是种上皮样细胞。贴壁尘长，购于北京健翔和牧生物科技有限公司ＰＲＲＳＶ活疫苗毒株购于广州大华农动物保健品股份有限公司。１．２主要仪器倒置显微镜（ＣＫＸ４１ＳＦ型；日本ＯＬＹＭＰＵＳ）细胞培养箱（ＨＦ１００型；上海力申科学仪器有限公司）超低温冰箱（ＭＤＥＬ７０２；美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）－－．工作台（ＳＷＣＪＣＯ型）超净；苏州细胞培养板（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）低速冷冻离也机Ｃ－２０４４型ＺＯＮＫＩＡ）（ＫＤ；科大创新股份有限公司中佳分公司恒湿水浴锅（ＳＡＰ１２型；英国）移液器（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）酶标仪（ＭＫ３型；美国Ｔｈｅｒｍｏ）压力蒸汽灭菌器（日本Ｓａｎｙｏ）１．３主要试剂及其配制１．３．１主要试剂ＤＭＥＭ高糖培养基购自美国ＨＣｌｏｎｅ公司，０．０１Ｍ的ＰＢＳ稱酸缓冲液、肤蛋白ｙ－二甲ＤＭＳＯ酶（含ＥＤＴＡ２Ｎａ）、四甲基偶氮嗤蓝（ＭＴＴ）及基亚讽（）均购自北京Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。－－１３ １．３．２试剂配制（１）５％的ＤＭＥＭ细胞培养液：ＤＭＥＭ细胞培养液中加入５％的胎牛血清，配置‘好后４Ｃ保存。（２）２％ＤＭＥＭ细胞维持液：ＤＭＥＭ细胞培养液中加入２％的胎牛血清，配置好后°Ｃ４保存。（３）５ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ湿色液：在避光条件下，温水浴溶解０．５ｇＭＴＴ定容于ｌＯＯｍＬ‘ＰＢＳ缓冲液中ｍ微孔滤膜过滤器过滤除－，用０．２２２０Ｃ避。ｎ菌，光保存２试验方法２－．１Ｍａｒｃ１４５细胞的培养丄－２１Ｍａｒｃ１４５细胞的复苏°ｒｃ－３７Ｃ的（１）将在液氮中冻存的Ｍａ１４５细胞取出，迅速转移至恒温水浴锅中溶解。（２）待完全溶解后，转移至离也管中，加５倍ＤＭＥＭ培养基稀释。’（３）置于低速冷冻离也机中于４Ｃ、ｌＯＯＯｎｎｐ条件下离也５ｍｉｎ，弃去上清。‘（４）加通量的５％细胞培养液将细胞重悬后转移到细胞培养板中，置于３７Ｃ、５％Ｃ０２培养条件下的培养箱中培养。２１－．．１Ｍａｒｃ１４５细胞的传代培养‘（１ａｒｃ－）培养于六孔板的Ｍ１４５细胞在３７Ｃ、５％Ｃ０２培养条件下的培养箱中生长至单层后，用移液器细胞培养板中的培养液吸出弃掉。‘ＥＤＴＡ－Ｃ、（２）每孔加入膜酶（含２Ｎａ）ＩｍＬ，放回３７５％Ｃ０２的细胞培养箱内消化，５ｍｉｎ后取出细胞培养板置于倒置显微镜下观察，待观察到８０％的细胞出现胞质回缩至球形，细胞间隙变大，则每孔加ＩｍＬ血清终止消化。（３）终止消化后用移液器充分吹打，然后移入离也管中，置于低速冷冻离也机中°４Ｃ、ｌＯＯＯｒａｉｐ条件下离也５ｍｉｎ，弃去上清。°Ｃ（４）加适量５％细胞培养液将细胞重悬后，转移到新的细胞培养板中，置于３７、５％Ｃ０２培养条件下的培养箱中培养。－２丄２Ｍａｒｃ１４５细胞的冻存’３７Ｃ、５％Ｃ０培养条件下培养至单层的Ｍ－１４５细在２ａｒｃ胞，用膜酶进行消他后，’用血清终止消化，然后置于低速冷冻离也机中４Ｃ、ｌＯＯＯｍｉｐ条件下离也５ｍｉｎ后弃去‘’Ｃ２０ｍ－Ｃ上清，加入适量的细胞冻存液重悬后，分装入细胞冻存营中。４放置ｉｎ，２０－－１４ ‘放置－－１２小时，８０Ｃ过。夜，最后转入液氮中标记好日期长期保存２．２ＰＲＲＳＶ的扩增和收获２．２．１ＰＲＲＳＶ的扩増°（－巧１）将接种于细胞培养板的Ｍａｒｃ１４５细胞在Ｃ、５％Ｃ０２培养条件下的培养箱中培养至单层。（２）ａｒｃ－取适量的用培养基稀释的猪繁殖与呼吸征疫苗（活苗）接种于Ｍ１４５细’Ｃ胞上，轻轻转动培养板，使得病毒液均匀的完全覆盖细胞，于３７、５％Ｃ０２培养条件下的培养箱中培养化。（３）弃去病毒液，加入２％的细胞维持液，培养至８０％Ｗ上细胞病变时收集病毒。２２ＰＲＲＳＶ．２．的收获’（１）当８０％＾上细胞病变时自细胞培养箱中取出－Ｃ反，置于２０复冻融王次。（２）用移液器充分吹打使细胞悬浮，转移至离也管，ＳＯＯＯｒｐｍ离也３０ｍｉｎ。（３）１上清液经化２２畔的微孔滤器过滤除菌，分装到ＥＰ管中，标记好日期、批次。’°－（４）４（：条３〇１１１１１１预冷（：件下放置，后经８０过夜，转移至液氮中长期保存。２．３药物的细胞毒性测定２．３．１药物的溶解针对绿原酸、表告依春和淫羊養巧的溶解特点选择３％乙醇为助溶剂，然后溶于２％的维持培养基中使得巧始浓度为２００（Ｈｉｇ／ｍＬ进行倍比稀释，测定药物的细胞毒性试验。２．３．２药物的细胞毒性测定‘（９６－４５１）将接种于孔细胞培养板的Ｍａｒｃ１细胞在３７Ｃ、５％Ｃ０２培养条件下的培养箱中培养至单层。（２）将待测药物溶解后，用连续２倍倍比稀释的方法稀释为８个不同浓度，按每孔入到弃去培养液的－１００阵，共４个重复Ｍａｒｃ１，加，有培养至单层的４５细胞的９６°孔板中。同时设有只加１００ｌＬ的２％细胞维持液的对照组３７（：、５％。置于（：〇２培养条＾件下的培养箱中培养。‘（３）培养７２ｈ后弃去上清液，每孔加入２０阵的ＭＴＴ后，置于３７Ｃ、５％Ｃ０２培养条件下的培养箱中培养他。°（４）弃去ＭＴＴ，每孔加入１５０咕ＤＭＳＯ，置于３７Ｃ、５％Ｃ化培养条件下的培养５￣箱中培养１０ｍｉｎ。－－１５ （５）使用酶标仪测定４９０ｎｍ处的ＯＤ值，同时Ｗ６３０ｎｍ作为参比波长，记录数据。（６）Ｗ观察的细胞病变程度Ｗ及所测得ＯＤ值为依据，用下列公式计算药物至细胞的病变率。＝〇誦病变率Ｘ１００／〇细胞对照组〇〇值３试验结果３－细胞培养＾及攻．１Ｍａｒｃ１４５毒结果－图１正常Ｍａｒｃ１４５细跑及攻毒细胞培养结果－（Ａ）正常培养的Ｍａｒｃ１４５细胞Ｂ）Ｍａｒｃ－１４５〔攻毒的细胞－－１Ｎ抑ｍａＦｉ．ｌＭａｒｃ１４５ｃｅｌｌｓａｎｄＭａｒｃ１４５ｃｅｌｌｓｎｆｅｃ化ｄＰＲＲＳＶｇｉｂｙ（Ａ）Ｎｏｒｍａ－１４５ｌ－１４５ｌＭａｒｃｃｅｌｓ（Ｂ）Ｍａｒｃｃｅｌｌｓｉｎ拓ｃ化ｄｂｙＰＲＲＳＶ－由Ｗ上结果可见，正常状态下培养的Ｍａｒｃ１４５细胞，细胞形态正常，呈现单层生长且完整的铺满细胞培养板底部一，细胞大小基本均，均匀，细胞与细胞之间的界限－，并且有较强的折光率。Ｍａｒｃ１４５ＰＲＲＳＶ明显细胞加入７２ｈ后，细胞出现明显病变，一可见细胞大小不均，多数细胞变圆并且脱落，有些细胞细胞质出现空泡化，细胞无法生长为完整的单层细胞，细胞与细胞之间的界限不清。３．２药物的細胞毒性测定结果通过添加药物后所导致的细胞病变（细胞变圆并脱落，细胞轮廓模糊不清，细胞质空泡化，聚集成簇等），测定出可Ｗ使９０％Ｗ上细胞正常存活的药物浓度即为最大安全浓度。对细胞病变率的计算结果显示，绿原酸的最大安全浓度为：５００帖／ｍＬ，表－－１６ 告依春的最大安全浓度为；ｌＯＯＯ／ｍＬｎｇ，淫羊蕾巧的最大安全浓度为；３１．２５ｎｇ／ｍＬ。４小结一一加入ＰＲＲＳＶ后的Ｍａｒｃ－５１４细胞出现定的病变现象，但还需进步确定是否是病毒感染所致，Ｗ确巧所使用的ＰＲＲＳＶ活疫苗可Ｗ在本实验室的培养条件下感染ａｒｃ－Ｍ１４５细胞－４５。通过药物的细胞毒性试验，测定了所选用的试验药物在Ｍａｒｃ１细胞上的最大安全浓度，为后续试验中药物浓度的使用提供了科学依据，从而保证后续试验的真实性与可行性。－－１７ 试验二ＰＲＲＳＶ对Ｍａｒｃ－１４５细胞感染巧的测定本试验旨在通过ＲＴ－ＰＣＲ方法测定所购疫苗中的ＰＲＲＳＶ是否能够成功扩增与收一ｒｃ－１４５Ｍａ，获，并且感染细胞，且可Ｗ具有定的毒力作用。同时用免疫细胞化学方法测定病毒对Ｍａｒｃ－１４５细胞的侵染作用Ｗ及ＰＲＲＳＶ在细胞中的定位。１试验材料１．１试验用细胞及病毒来源一同试验。１．２主要仪器普通ＰＣＲ仪（美国攻ｏＲＡＤ公司）。制冰机（日本Ｓａｎｙｏ公司）ｎｏｄｒｏ－００型ｔｈｅｒｍｏ核酸蛋白测定仪（ＮａｐＮＤ１０，美国公司）超低温冰箱（ＭＤＥＬ７０２型；美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）移液器（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）高速冷冻离也机（３Ｋ３０型；德国Ｓｉｇｍａ公司）压力蒸汽灭菌器（日本Ｓａｎｙｏ）－ＢＰ３３０型Ｐａｎａｓｏｎｃｉ公司）凝胶成像系统（ＷＶ；日本电泳槽一（北京六仪器厂）。光学显微镜（ＤＭＬＢ２型；德国Ｌｅｉｃａ公司）数码相机（ＤＰ７１型；日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）电子分析天平（ＡＲ１１４０型；美国奥豪斯国际贸易有限公司）－９恒温赔育箱（ＨＰＰ１的型；北京东联哈尔仪器制造公司）冰箱（ＢＣＤ－５海尔公司）１６型；保湿盒（协力塑料制品厂）１．３主要试剂及其配制１．３．１主要试剂Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ购自大连Ｔａｋａｒａ公司，２ＸＥｓＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ（含染料）、ＤＭ１０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ均购自北京康为试剂有限公司，５ＸＴＡＥ缓冲液购自北京索莱宝公司，氯仿、异丙醇、无水立醇－－１８ 等均为分析纯。一抗多克隆兔抗ＰＲＲＳＶ本试验所用Ｍ蛋白抗体购自北京博奥森技术有限公司，４％的多聚甲酵溶液Ｗ及０．０１Ｍ的ＰＢＳ磯酸缓冲液购自北京Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司，免疫组化试剂盒（其中包含３％的Ｈ２０２去离子水、山羊血清封闭液、生物素标记的山羊抗兔ＩｇＧ二抗Ｗ及辣根过氧化物酶栋记链霉卵白素工作液）购自北京博奥森技术有限公司，ＤＡＢ显色试剂购自武汉博±德生物有限公司，无水乙醇、二甲苯等试剂均为分析纯。－一渉及细胞培养试剂同试验。１．３．２试剂配制（ＯＤＥＰＣ水：在高压并烘干的玻璃瓶内装入蒸馈水，然后加入０．０１％的ＤＥＰＣ原液，放置过夜后，高压灭菌，制备无ＲＮＡ酶的灭菌水。（２）７５％冰乙醇：制备好的ＤＥＰＣ水配制７５％的石醇，装入经高压灭菌并烘干的‘玻璃瓶中，存放于４Ｃ。ｘ（３）１％琼脂糖凝胶配制；称取０．２ｇ琼脂糖，加入到２０ｍＬ的ＩＴＡＥ缓冲液中微波炉加热溶解。２试验方法２－．１ＲＴＰＣ民检测病毒对细胞的感染性２丄１引物设计－参照ＮＣ：ＢＩＰＲＲＳＶ基６序列给出的因全序列中的ＯＲＦ，使用软件ｐｒｅｍｉｅｒＳ．Ｏ设一对引物计，将引物序列交由北京华大基因合成。引物序列见表１。表－６１ＯＲＦ扩増引物Ｔａｂ－ｌｅｌＴｈｅＰｒｉｍｅｒｏｆＯＲＦ６＇引物序列－（５３＾＇’ＰｒｍｅｒＳｅｕｅｎｃｅ５—３ｉｑ（）ＯＲＦ－６ｆｏｒｗａｒｄｒｍｅｒＧＡＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＴｐｉＯＲＦ－６ｒｅｖｅｒｓｅｒｍｅｒＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＧＡＧＧＣＴＴＴＴｉｐ－－１９ ２丄２总ＲＮＡ提取一（１）按照试验方法在六孔细胞培养板中培养细胞并设置攻毒试验组与空白对照组，４８小时后将细胞培养板取出，弃去上清，并用ＰＢＳ冲洗。（２）每孔加入ＩｍＬＴｒｉｚｏｌ，用细胞刷将细胞从底部刮下，使Ｔｒｉｚｏｌ充分裂解细胞。（３）Ｗ每ＩｍＬＴｒｉｚｏｌ中加入０．２ｍＬ氯仿的比例，加入氯化充分震荡后，室温°静置３ｍｉｎ，随后４Ｃ条件下，１２０００ｒｐｍ，离也１５ｍｉｎ。（４）将上清液转移到经ＤＥＰＣ水处理过的１．５ｍＬ邱管中，按比例（Ｔｒｉｚｏｌ：异丙醇为２：１），向上清液中加入异丙醇，充分混匀后，室温静置ｌＯｍｉｎ。然后１２０００ｉｐｍ，°４Ｃ条件下，离也ｌＯｍｉｎ。（５）弃去上清液，加ＩｍＬ７５％的冰乙醇到离也管中，轻轻颠倒，使沉淀充分洗°緣。然后７５００ｒｐｍ，４Ｃ条件下，离也５ｍｉｎ。？邸（６）小也弃去７５％的冰乙醇，将产物进行真空干燥３５ｍｉｎ，然后在替中加入５０叫＾无ＲＮＡ酶的ＰＥＰＣ水，使沉淀物充分溶解。（７）使用核酸蛋白测定仪测定所提取的样品总ＲＮＡ的浓度，并测定所提取样品‘－Ｃ的ＯＤ２６０／２８０和ＯＤ２６０／２３０比值，判断所提取的ＲＮＡ质量。分装后８０保存。２丄３ｃＤＮＡ的合成（１）将所提取的总ＲＮＡ样品用反转录试剂盒反转录为ｃＤＮＡ采用两步法进行反Ｐ转录，在Ｅ管中配制Ｗ下反应体系：ＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒ５０Ｍ１Ｌ（片）ＨｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ１０ｍＭｅａｃｈｌ，Ｌ（）ｐＴｏｔａｌＲＮＡ２．ｐｇＲＮａｓｅＦｒｅｅｄＨ２〇ｕ化１ＯＬｐｐ°（２）将上述反应液充分混合均匀，在６５Ｃ条件下巧育５ｍｉｎ，然后迅速将其置于冰上使之冷却。然后继续加入下列反应体系：５ＸＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩＢｕｆｆｅｒ４ｉＬ＾ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ４０Ｕ／ｉＬ０．５（＾）咕ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩＲＴａｓｅｌ，ＬｐＲＮａｓｅＦｒｅｅｄ＆Ｏｕｐ化２０（＿ｉＬ‘配置好上述反应液后，将其轻轻摇匀，在ＰＣＲ仪中进行下列反应：４２Ｃ，４５ｍｉｎ；’‘７０Ｃｍｉｎ。反应－，１５结束后，用核酸蛋白测定仪测定所得产物的浓度并保存于２０Ｃ备用。－２０－ ２丄３ＰＣＲ产物扩増ＰＣＲ利用扩増ＰＣＲ产物，反应体系如下：２ＸＥｓＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ５ｐ，Ｌ－ｆｏｒｗａｒｄｒ１ｉｊＭ）０，ＬＯＲＦ６ｒｉｍｅ（０．４ｐ＾｜－ｒｅｖｅｒｓｅｅｒＯＲＦ６ｒｉｍ（１０ｊ，Ｍ）０．Ｌ（如ｐｃＤＮＡ２ｎＬ加Ｈ２ＯｕｐｌｏｌＯｐＬＰＰＣＲ反应４０将反应液于Ｅ管中配置好均匀混合，进行，总共个循环，反应结‘束后４Ｃ保存。反应条件如表２：表２普通ＰＣＲ反应条件－Ｔａｂｌｅ２ＴｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆＰＣＲｆｏｒＯＲＦ６反应步骤反应程序湿度ｒｃ）时间ＳｔｅｐＰｕｒｐｏｓｅＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＴｉｍｅ１预变性９５５ｍｉｎ２变性９５３０ｓ３退火部３０ｓ４延伸７２３０ｓ５终延伸７２５ｍｉｎ２丄４ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳（１）用ＴＡＥ缓冲液配制１％的琼脂糖凝胶，琼脂糖溶化后加入漠化己锭（ｌＯｍｇ／ｍＬ）使其最终浓度为０．５ｎＬ。（２）混匀后灌入胶板，插入梳子，待胶凝固后，将凝胶放入电泳槽中，加入ＩＸＴＡＥ电泳缓冲液至没过胶板为止，将梳子拔出。£民扩増一＾个重（３）每５叫＾？产物加１＾１１＾的上样缓冲液，加入个上样孔中，共复。一ＤＮＡＭ一（４）在其中个上样孔中加入ＤＭｌＯＯＯａｒｋｅｒ为分子量标准，另设孔为对照。（５）加样完毕后，在１００Ｖ条件下进行电泳，当漠酷蓝接近胶板下边缘约２ｃｍ时停止电泳。（６）电泳完成后在凝胶成像系统中观察电泳情况。－－２１ ２．２细胞免疫化学测定病毒对细胞的感染性２．２．１制作细胞爬片：（１）先将规格为１８Ｘ１８的盖玻片用砂轮切割成四份，Ｗ备置于２４孔板中。（２）将剪裁好的盖玻片放于络酸溶液中浸泡２４ｈＷ上，然后用蒸馈水将玻片洗净。（３）把处理好的盖玻片放于小烧杯中，用锡箱纸封口，高压灭菌，放于烘箱中烘干。（４）ａｒｃ－１４５细胞从液氮中取出复苏将Ｍ，并在培养箱中进行培养。当细胞达到９０％汇合时进行传代。（５）传代时将处理好的盖玻片用綴子加起，在酒精灯上加热再次灭菌，冷却后平放入２４孔培养板中。（６）用膜酶对细胞进行消化后用适量培养基重悬，毎化中加入等量细胞悬液，再’加适量的５％细胞培养液，置于３７Ｃ、５％Ｃ０２培养条件下的培养箱中培养。一ｒｃ－（７）当Ｍａ１４５细胞生长至单层时，弃掉培养液换为维持液，按照试验病毒。扩増的方法给细胞攻毒，同时设不加病毒的空白对照组（８）细胞在培养箱中培养适当时间后进行免疫细胞化学试验。２．２．２免疫细胞化学试验（１）ｒｃ－ＰＢＳ冲将Ｍａ１４５细胞自培养箱中取出，用洗３次，每次３ｍｉｎ，每孔加’入５００ｉＬ的４％的多聚甲酵溶液，放入３７（：恒溫解育箱。＾（２）固定３０ｍｉｎ后取出，用ＰＢＳ冲洗３次，每次３ｍｉｎ，每孔滴加３％双氧水，°３７Ｃ恒湿解育２０ｍｉｎ后，ＰＢＳ冲洗３次，每次３ｍｉｎ。’（３）每孔滴加山羊血清封闭液，覆盖细胞，３７Ｃ恒湿脖育２０ｍｉｎ。一（４）用移：液器弃去封闭液，勿洗，滴加抗（１１００用ＰＢＳ稀释）覆盖细胞，放‘二天取出’Ｃ过，置于Ｃ入冰箱４夜，第３７恒温解育箱中复温３０ｍｉｎ。二’（５）ＰＢＳ冲洗３次，毎次３ｍｉｎ后，滴加山羊抗兔ＩｇＧ抗，３７Ｃ恒温解育２０ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗３次，每次３ｍｉｎ。’Ｃ（６）滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，巧恒温解育２０ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗３次，每次３ｍｉｎ。一（７）避光条件下滴加显色剂ＤＡＢ（１毫升蒸馈水中加入Ａ液、Ｂ液、０液各－ｍｎ，滴，摇匀避光），室温显色５ｌＯｉ观察到有颜色变化后蒸馈水冲洗３次３ｍｉｎ。，每次（８）每孔加入适量苏木精溶液，浸泡１５ｍｉｎ后，蒸馈水冲洗干净。（９）进行脱水透明：７０％乙醇２ｍｉｎ；８０％乙醇２ｍｉｎ；９０％芒醇２１１血；９５％乙醇２－２２－ 次，每次３ｍｉｎ；无水乙醇２次，每次４ｍｉｎ；二甲苯２次，１０ｍｉｎ＋５ｍｉｎ。（１０）用中性树脂封片，防止细胞氧化。（１１）待中性树胶干透后进行观察。３试验结果３－．１ＲＴＰＣ民检测病毒对细胞的感染性结果ｌｏｏｏｂｐ７００ｂｐ己ＯＯｂｐｌｏｏｂｐｍｂｐ應口１２３４２－图ＲＴＰＣＲ结果－Ｆｉｇ．２ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＲＴＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳结果如上图，，可见，未攻毒的空白对照组第１泳道未出现目的条带，而在试验组的１２２ｂｐ处出现目的条带（２、３、４泳道），这与所设计的目的基因片段大小是一致的。３２免细胞化学测定病毒对细胞的感染性的结果．疫免疫细胞化学试验结果如图３所示，图中踪纪色染色指示病毒颗粒抗原的存在，蓝紫色指示细胞核Ｗ及细胞质中碱性物质，。由图可见，未加病毒的细胞形态正常攻毒培养的细胞出现明显的病变，并检测到了病毒抗原。－２３－ 禪强歡踩巧公勺础巧聲ｔ．占听拆；勾！Ｄ＊沁獻；必１＾＞屋＾＾图３免疫细胞化学测定病毒对Ｍａｒｃ－１４５细胞的感染性的结果一（Ａ）ＰＲＲＳＶＭａｒｃ－１４５用的Ｍ蛋白抗体作为，抗，正常细胞未出现阳性反应且细胞呈现－４ＰＲＲＳＶ完整的单层，细胞形态正常，边界清晰。（Ｂ）攻毒７２ｈ的Ｍａｒｃ１５细胞出现了的Ｍ蛋白阳性反应，细胞易脱落，且细胞裂解，细胞核固缩，着色较深。（Ｃ）用ＰＢＳ代替Ｍ蛋白抗体，作为对照组的正常细胞，未出现阳性反应。（Ｄ）用ＰＢＳ代替Ｍ蛋白抗体，作为对照组的攻毒细胞，未出现阳性反应。Ｆｉ－．３ＩｍｍｕｎｏｈｓｔｏｃｅｍｃａｌｏｃａｚａｔｏｎｏｆＰＲＲＳＶｎＭａｒｃ１４５ｃｅｌｌｓｇｉｈｉｌｌｉｉｉＡＷｅＭｒｏｅ打ｏＰＲＲＳｓｔｓｔａｎｔｏｄｎｏｒｍａ－１４５ｃｅｌＭａｒｃｌｓｄｎｏ（）ｉ也化ｐｔｉｆＶａ打ｔ化ｏｄｉｅｓａｈｅｆｉｒ化ｙｌ出ｔ，ａｅａｒｏｓＵｉｖｅｈｅｃｅｌｌｓｓｈｏｗｅｄｉｎａ。ｍｏｎｏｌａｒｓ打ｏｒｍａｌｃｅｌｌｍｏｒｈｏｌｏｌｅｒｂｏｕｎｄａｒ．Ｂｐｐ，ａｎｄｔｔ，ａｐｙｅ，ｐｇｙｃｙ（）ｏｓｏｎ－７２ｈｐｉａｔｔａｃｋｏｆＭａｒｃ１４５ｃｅｌｌｓｓｈｏｗｅｄａｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｏｓｉｔｉｖｅＭｐｒｏｔｅｉ打ｏｆＰＲＲＳＶｃｅｌｌｓｈｅｄｄｉｎ，ｇ，ｇｐａ打ｄｃｅｌｌｌｙｓｉｓ，ｋａｒｙｏｐｙｋｎｏｓｉｓ，ｄａｒｋｅｒｃｏｌｏｒｉｎ昏（Ｃ）ＷｉｔｈＰＢＳｉｎｓｔｅａｄｏｆＭｐｒｏｔｅｉ打ａ打ｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｓｎｏｒｍａｌｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｎｏｐｏｓｉｔｉｖｅｒ的ｐｏｎｓｅ．（Ｄ）Ｉｎｓ化ａｄｏｆＭｐｒｏｔｅｉｎａｎｔ化ｏｄｙｗｉｔｈＰＢＳａｓａｃｏｎｔｒｏｌｒｏｕｏｆ．ｃｅｌｌｓａｔ巧ｃｋｖｉｒｕｓｄｏｅｓ打ｏｔａｅａｒｏｓｉｔｉｖｅｇｐｐｐｐ－２４－ ４小结ＰＲＲＳＶ能琼脂糖凝胶电泳结果Ｗ及细胞免疫化学结果表明，够在本试验采用的培－养条件下对Ｍａｒｃ１４５细胞进行感染，并且病变，攻毒细胞确能够使细胞发生明显病变ｒｃ－ＰＲＲＳ是由于ＰＲＲＳＶ在细胞中的侵染所致，说明实验所用Ｍａ１４５细胞可感染病毒，并且可观察到病毒的侵染部位是细胞质。－２５－ 试验兰免疫细胞化学法测定药物对ＰＲＲＳＶ感染细胞的抑制作用一试验中测定了本试验所选择的药物对Ｍａｒｃ－１４５二检测到细胞的安全浓度，试验病变的细胞中含有ＰＲＲＳＶａｒｃ－，确定了Ｍ１４５细胞的病变是病毒侵染所致，而本试验旨在使用细胞免疫化学的方法测定所选试验药物在安全浓度下是否对蓝耳病病毒感染ａｒｃ－４５细胞Ｍ１有抑制作用。１试验材料１．１试验用细胞、病毒ｋ乂及药物来源一细胞及病毒来源同试验，试验药物（绿原酸、表告依春和淫羊奮巧）购自成都瑞芬思生物科技有限公司。１２主要仪器．光学显微镜（ＤＭＬＢ２型；德国Ｌｅｉｃａ公司）数码相机（ＤＰ７１型；日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）电子分析天平（ＡＲ１１４０型；美国奥豪斯国际贸易有限公司）移液器（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）－９恒溢解育箱（ＨＰＰ１６２型；北京东联哈尔仪器制造公司）ＣＤ－冰箱化１６５型；海尔公司）保湿念（协力塑料制品厂）１．３主要试剂及其配制本试验所用主要试剂同试验二细胞免疫化学部分试验相同。２试验方法本试验方法与试验二中的细胞爬片及细胞免疫化学部分相同，但在给细胞攻毒的同时加入待测定的药物，并调整使之为细胞的安全浓度。－２６－ ３试验结果试验结果如图４所示，图中掠红色染色指示病毒颗粒抗原的存在，蓝紫色指示细胞核Ｗ及细胞质中碱性物质。可见添加药物绿原酸与表告依春的试验组中，没有检测，添加淫羊蕾昔的试验组检测到病毒存在到病毒抗原。＇，？方参Ｌ‘＊，＾，涕？＾Ｖ＾＊－乐＊巧，＊．，？心Ｋ？＃＊，？言／？．巧．Ｉ１－？？．‘＊＊？Ｗ＇＞＊帝，来－片＊＃参？；二ｉ，‘々？寒＇Ｊ－－■ＸＶ＂＊ｓｏｐｍ巧姐Ａ，４．—２；迎扩Ｖ５Ｄ＾Ｅ衣琴－與＊．、？．Ｉ１ｔｅ＿＊＊ｉ图４ａｒｃ－免疫细胞化学测定病毒对Ｍ１４５细胞的感染性的结果Ａ）（Ｂ）（Ｃ）分别是（绿原酸、表告依春、淫羊霍巧与ＰＲＲＳＶ同时加入细胞培养７２ｈ，ＷＰＲＲＳＶ的Ｍ蛋白作为一ＰＲＲＳＶ的Ｍ室抗，试验结果中，（Ａ）（Ｂ）中未见细胞对白出现阳性反应，（Ｃ）中出现少量被ＰＲＲＳＶ感染的（Ｄ）（）ＰＲＲＶ加入细细胞，但总体也少于攻毒对照组。ＤＳ２ｈ一，ＷＰＲＲＳＶ的Ｍ蛋白作为ＰＲＲＳＶ的Ｍ蛋胞培养７抗，试验结果中，可见细胞对白出现了阳性反应。（Ｅ）用ＰＢＳ代替Ｍ蛋白抗体，，作为对照狙的攻毒细胞未出现阳性反应。（Ｆ）用Ｍ蛋白抗体为一抗，，未出现阳性反应作为对照组的正常细胞。４ＩｍｍｕｎｏｈｉｓＲＲＳＶｍＭ－４巧昏ｔ：ｏｃｈｅｉｃａｌｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｆＰｒｃ１５ｃｅｌｌｓｍｏａ（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）ａｒｅｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄ，ｅｐｉｇｏｉｔｒｉｎ，ｉｃａｒｉｉｎａｎｄＰＲＲＳＶｓｉｍｕｋａ打ｅｏｕｓｌｙａｄｄｅｄｔｏｔｈｅｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ７２ｈｗｉ化ＰＲＲＳＶＭｒｏｔｅｉ打ａｓａ打ａ打ｔｉｂｏｄ化ＳｔｒｅｓｕｈｓＡＢｉｓｎｏｔｏｂｓｅｒｖｅｄｃｅｌｌｓｓｈｏｗｅｄｏｓｉｔｉｖｅ，ｐｙ（（）ｐ，）ｒｅａｃ－ｔｉｏｉＵｏ化ｅＭｒｏｔｅｉｎｏｆＰＲＲＳＶＣａｅａｒｓａｓｍａｌａｍｏｕｎｔＰＲＲＳＶｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓｂｕｔａｌｓｏｌｅｓｐｌｓ，（ｐｐ，）ｈａｎｅｏｖｅｒａＲＲＶＭｔ化ｌｌｃｈａｌｌｅｎｅｃｏｎｔｒｏｌｒｏｕＤ．ＤＰＲＲＳＶａ加ｅｄ化化ｅｃｅｌｌｃｕｌｕｒｅ７２ｈｗｉ化ＰＳｇｇｐ（））ｔ，（ｒｏ化ｉｎａｎｉｂＳｒｅｓｕｓｓｔＲＲＶＭｒｏｅｎａｅａｒｅｄａｓａｏｓｔｖｅｒｅａｃｔｏｎｐｔｏｄｙ化ｔｌｔ，ｈｏｗｉｎｇｈａｔｃｅｌｌｓＰＳｐｔｉｐｐｐｉｉｉ．巨（）ｉｎｓｔｅａｄｏｆＭｐｒｏｔｅｉ打ａｎｔｉｂｏｄｗｉ化ＰＢＳａｓａｏｎ化ｏｌｒｏｕｏｆｃｅｌｌｓａａｃｋｖｉｍｓｄｏｅｓ打ｏｒｏｓｉｔｉｖｅ．ｃｔｔａｙｇｐｐｐｅａｐ－２７－ Ｆｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｂｏｄａｓ也ｅａ．ｗｋｈｔｈｅＭｙｎｏｒｍａｌｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｒ出ｄｎｏｔａｐｒｏｓｉｔｉｖｅ（）ａｎｄ，ｏｕｐ，ｐｅｐｇｐ４小结试验结果显示，绿原酸、表告依春与ＰＲＲＳＶ同时加入细胞培养７化，ＷＰＲＲＳＶ的Ｍ蛋白作为一抗，未见细胞对ＰＲＲＳＶ的Ｍ蛋白出现阳性反应。淫羊蕾昔与ＰＲＲＳＶ一ＲＲ同时加入细胞培养７２ｈ，ＷＰＲＲＳＶ的Ｍ蛋白作为抗，则出现了少量细胞受ＰＳＶ感染的情况，但数量少于攻毒的对照组。说明绿原酸、表告依春可对ＰＲＲＳＶ感染一Ｍａｒｃ－１４５细胞起到抑制作用，而淫羊蕾昔对ＰＲＲＳＶ可Ｗ起到定的抑制作用，但效果不如绿原酸与表告依春Ｍａｒｃ－。在试验过程中５，通过对１４细胞的形态观察，发现绿原酸所起到的抗病毒作用最好，表告依春次之，而淫羊蕾昔起到的作用最不理想。试验中，作为对照的攻毒组出现了明显的阳性反应，而作为对照的未攻毒组未出现阳性反应，说明该试验结果真实可信。－２８－ 试验四药物对ＰＲＲＳＶ诱导的细胞调ｆ：的影响己有研究表明ＰＲＲＳＶ可通过某些调亡机制来诱导细胞调ｔ，细胞调亡有利于。病毒粒子在组织与细胞中释放与扩散，故而被感染的组织中会出现大量的调亡细胞本试验旨在探究添加的药物是否可有效抑制ＰＲＲＳＶ对细胞调亡的诱导。Ｍａｒｃ－１４５前期的研究显示，，所添抗病毒成分能抑制病毒导致的细胞病变本试验采用ＴＵＮＥＬ法检测细胞调亡情况，目的是探索其抗病毒机制是否是通过细胞调亡机制来发挥抗病毒作用。１试验材料１．１试验用细胞ｋ乂及药物来源、病毒同试验二。１．２主要仪器－９恒温巧育箱（ＨＰＰ１６２型；北京东联哈尔仪器制造公司）移液器（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）一其他涉及细胞培养仪器同试验。１．３主要试剂及其配制ＬＴ酶稀ａｖｉｄｎ－本试验所用ＴＵＮＥ细胞调亡检测试剂盒（内含Ｔｄ释液、ＳｔｒｅｐｔｉＨＲＰ、Ｓ－－ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＨＲＰ稀释液、ＴｄＴ酶、ＢｉｏｔｉｎｄＵＴＰ、ＤＡＢ显色液Ａ、ＤＡＢ显色液ＢＷ及标记反应终止液）购自江苏碧云天生物技术研究所，化０１Ｍ的ＰＢＳ磯酸缓冲液购自北京Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司，无水乙醇、二甲苯等试剂均为分析纯。２试验方法（１）按照试验Ｈ方法进行细胞爬片、添加药物Ｗ及细胞攻毒，在细胞培养箱中进巧培养适当时间。（２）ａｒｃ－１４５３３ｍ将Ｍ细胞自培养箱中取出，用班Ｓ冲洗化毎次ｉｎ，每孔加°５００４％Ｃ３０ｉ入咕的的多聚甲醒溶液，３７恒温膊育箱中放置ｍｎ进行固定。（３）取出后，用ＰＢＳ冲洗３次，每次３ｍｉｎ。（４）按照调亡检测试剂盒说明书配制生物素标记液，每个细胞爬片滴加５０＾ｉＬ，－２９－ °３７Ｃ恒湿解育箱中放置３０ｍｉｎ进行解育。（５）取出后ＰＢＳ冲洗１次，滴加Ｏ．ｌｍＬ的标记反应终止液，室温放置ｌＯｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗３次，每次３ｍｉｎ。（６）按－照说明书配制Ｓ仕ｅｐｔａｖｉｄｉｎＨＲＰ工作液Ｗ及ＤＡＢ显色液。（７）５０Ｓｒｅａｖｎ－ｍｎ每个细胞爬片上滴加阵ｔｐｔｉｄｉＨＲＰ工作撤室温胀育３０ｉ，然后ＰＢＳ冲洗３次，毎次３ｍｉｎ。（８）每个细胞爬片上滴加２０〇ｎＬＤＡＢ显色液，室温巧育３０ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗３次，每次３ｍｉｎ。（９）每孔加入适量苏木精溶液，浸泡１５ｍｉｎ后，ＰＢＳ冲洗３次，每次３ｍｉｎ。（１０）按照试验Ｓ的步骤，对细胞爬片进行脱水、封片处理。（１１）每孔加入适量苏木精溶液，浸泡１５ｍｉｎ后，蒸馈水冲洗干净。（１２）进斤脱水透明；７０％乙醇２ｍｉｎ；８０％乙醇２ｍｉｎ；９０％乙醇２ｍｉｎ；９５％乙醇２次，毎次３ｍｉｎ；无水艺醇２次，毎次４ｍｉｎ；二甲苯２次，１０ｍｉｉｉ＋５ｍｉｎ。（１３）用中性树脂封片，防止细胞氧化。（１４）待中性树胶干透进行观察。３试验结果试验结果如图５所示，栋红色与蓝紫色均指示细胞的细胞核，其中栋红色指示该细胞发生调亡，蓝紫色指示未发生调亡的正常细胞。试验结果可见添加药物后确实可一Ｗ抑制细胞发生调亡，但其作用效果有定差别。－３０－ 參＞？？去Ａ＊》Ｌ？？＊？＊？？，？＊乂Ｗ？？？ｒｒ？？－？乐？，，？，＊？＊？＊ｆ杰？？＇．－＊＊＊．；Ａ迎＾茫迎ｉｓｐｈＣＩ＂，．．＂＇、‘－－■．！巧Ｉ＂＂＂ｗｐＭ巧ｊ朔－ｉｉｗ——ｍｍｉｕ＾ｒ發＆鳴一乐参案５吊，Ａｈ＊■ｆｍ考■２５＾ＳＤ邮Ｅｕｍ图５ＴＵＮＥＬ法检测细胞调ｔ结果（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）分别是绿原酸ＰＲＲＳＶ同时加入细胞培养７２ｈ（Ｄ）正、表告依春、淫羊霍昔与。常－培养的Ｍａｒｃ１４５细胞。（Ｅ）ＰＲＲＳＶ加入细胞培养７化。Ｆ．ｉｇ５ＲｅｓｕｌｔｓｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓｂｙＴＵＮＥＬａｓｓａｙＡＢＣａｒｅｃｈｌｏｒｏｅｎｉｃａｃｉｄｅｉｏｉｒｉｎｉｃａｒｎａｎｄＰＲＲＳＶｓｉｍｕｌａｎｅｏｕｓｌａｄｄｅｄｔｏｈｅｃｅｌｌｃｕｌｕｒｅ（）（）（）ｇ，ｐｇｔ，ｉｉｔｙｔｔＮｏｒｍａｌｃｕｌｔｕｒｅ－７２ｈ．ＤｄＭａｒｃ１４５．ＰＲＲＳＶａｄｄｅｄｉｅｃｅｃｕｔｕｒｅ７２（）ｃｅｌｌｓ化ｄｌｌｌｈ．（巧４小结由试验结果可见，未添加药物的病毒试验组，而，出现了大量的调亡细胞加入绿原酸与表告依春的试验组，细胞基本没有调亡，其调亡情况明显少于病毒试验组。加入淫羊蕾昔的试验组出现少量的细胞调亡情况。此结果说明加入的绿原酸、表告依春与淫羊蕾巧确实能够对ＰＲＲＳＶ引起的细胞调亡起到抑制作用，但是淫羊蕾昔的作用情况并不理想。－３－１ 分析与讨论ＰＲＲＳＶ的传播与流行已经给全世界各个大洲与地区的养猪业造成了极大的经济一一旦患病损失，由于仅仅采取使用疫苗进行预防的手段存在定的局限性，且，疫苗无法起到对患病个体有治疗效果。因此，能够研发对ＰＲＲＳＶ具有治疗作用的药物是十分紧迫的，。但具有抗病毒作用的西药在使用时往往会对宿主细胞造成不同程度的９２ｔ３损伤，并且有可能会存在病毒产生耐药性和个体药物残留的缺点。因此，从传统的抗病毒中药中筛选有效的天然抗病毒成分具有重要意义。本试验选取了传统具有抗病毒作用的中药金银花、板蓝根Ｗ及淫羊蕾中的主要成分绿原酸，，、表告依春和淫羊蕾昔试验论证其是否具有体外抗ＰＲＲＳＶ作用并从其对病毒的灭活作用与抑制由ＰＲＲＳＶ诱导产生的细胞调亡方面探讨其抗病毒机制。１绿原酸、表告依春ＬＸ及淫羊霍普抗ＰＲＲＳＶ作用分析一本试验的重要步骤之就是通过药物的细胞毒性试验，测定所选用的试验药物在－Ｍａｒｃ１４５９０ａｒｃ－１４５细胞上的最大安全浓度（可使％Ｗ上Ｍ细胞正常存活的浓度），从Ｍ－１４５而确定在试验中所用的药物浓度不会导致细胞病变，排除因为添加药物对ａｒｃ细胞所造成的影响，为后续试验中药物浓度的使用提供了科学依据，从而保证后续试验的真实性与可行性，。对细胞病变率的计算结果显示各个药物对细胞的最大安全浓度是不同的：绿原酸的最大安全浓度为５００以ｇ／ｍＬ，表告依春的最大安全浓度为－１００（Ｖｇ／ｍＬ，淫羊蕾巧的最大安全浓度为３１．２５帖／ｍＬ。在给Ｍａｒｃ１４５细胞攻毒的同时－ＰＲＲＳＶ加入最大安全浓度的药物，通过细胞免疫化学试验观察到Ｍａｒｃ１４５未受到的－４，感染。结果表明，绿原酸和表告依春可Ｗ有效的抑制ＰＲＲＳＶ对Ｍａｒｃ１５细胞的侵染而Ｈ种中药都可Ｗ对细胞调亡起到抑制作用。一绿原酸（ＣＨＡ）是种具有生物活性的机酸类物质，主要存在于忍冬科，杜仲科，是许多中草药及中药复方制剂的主要成分及菊科植物中，具有抗菌消炎、清热解ｔｗｉ毒功效，同时能够增强机体免疫力，还具有降糖、降血脂、保肝利胆和抗氧化等药，绿原酸还对伤寒杆菌，且效。研究还发现、大肠杆菌等均有良好的抑制作用毒性和副作用较小目前已经被广泛巧用于人类医药中，。体外研究显示绿原酸可显著增强由流感病毒抗原引起的Ｔ细胞殖，同时也可ｙＵ秀导人淋己细胞和人外周血白细６－９８＂口［］］－－ａＷ胞生成ＩＦＮＷ及ＩＦＮ，也能够提高大鼠体内的ＩｇＥ７。ａｎＹ、ＩｇＧ及心水平ｇ－ＧＦ等研究称，绿原酸可Ｗ对己肝病毒ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ起到抑制作用。有研究表明，绿原酸体外可Ｗ抑制柯萨奇Ｂ３、柯萨奇Ｂ５型、腺病毒７型、腺病毒３型Ｗ及合胞病－３２－ 毒。在本试验中还发现绿原酸具有体外抗ＰＲＲＳＶ作用。表告依春（ＥＰＩ）为中药板蓝根的提取物，属于生物碱，是板蓝根抗病毒的主要有。效成分。中药板蓝根具有消炎、抗病毒，解热、活血化疲的作用板蓝根在现代临床上经常被于病毒性疾病与细菌感染性疾病的治疗，尤其在呼吸道系统病毒感染性疾病ｉｗｆＰＲＲＳＶ的方面具有明显的作用效果。王学兵等研究发现板篮根多糖在体外具有抗ｉｗＲＳＶｔ，作用，可Ｗ对ＰＲ对细胞的侵染起到阻断与抑制作用。有研究报道板蓝根提取的总碱有在鸡胚试验中表现了抗流感病毒的作用，其中最主要抗病毒成分表告依春１０２１可＞？防［１８￥的作１＾１起到与总碱相同的效果１本试验中还发现，表告依春具有体外抗用。一淫羊蕾昔（ＩＣＡ）提取自有益补作用的中药淫羊蕾，已，是种黄丽昔类化合物有研究表明，淫羊蕾昔在骨骼系统、免疫系统、也脑化管系统、内分泌系统Ｗ及肿瘤系统都可起到重要作用。杜海斌等在研究淫羊蕾巧对体外培养的人外周血内皮祖细胞ＥＰＣｓ増殖作用的影响时发现，淫羊蕾巧能促进ＥＰＣｓ増殖，从而刺激缺血组织血（）ｉＷｔ管的新生和再生。赵连梅等研究发现，淫羊蕾昔可Ｗ消除由对环磯醜胺（Ｃｙ）所致的对小鼠骨髓和免疫抑制作用的影响，并且可Ｗ重建小鼠机体的免疫调节功能来保ＵＷ护其胸腺结构免受Ｃｙ的损伤。目前，有关淫羊蕾巧抗病毒作用的相关报道还相对一较少，，本试验发现淫羊蕾昔可Ｗ在体外对ＰＲＲＳＶ侵染细胞起到定的抑制作用但效果并不明显。综合Ｗ往的文献报道Ｗ及本试验所得结果可Ｗ得出，绿原酸与表告依春在体外具一有较明显的抗病毒作用。，有进步深入研究的可行性与必要性２试验药物抑制ＰＲＲＳＶ诱导的细胞调亡作用分析根据己有文献的报道，ＰＲＲＳＶ在体内或体外的细胞模型上均可Ｗ诱导细胞发生调ｅｓｅｒｎ法测定培养的Ｍａｒｃ－－亡。有文献报道采用Ｗｔｂｌｏｔ方１４５细胞中的ｃａｓｐａｓｅ３的活性，ｉＭ［］在６０ｈ时感染ＰＲＲＳＶ的细胞出现了明显的调亡。本试验采用细胞调亡可用原位末端标记法（末端脱氧核巧酸转移酶介导的生物素化的ｄＵＴＰ切口末端标记，Ｔｅｒｍｉｎａｄｅｏｘ－ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｂｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｂｉｏｔｉｎｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎＵＮＥＤＰＲＲＳＶｙｇ，Ｔ诱导产生的细胞调亡进行检测。并且已有研究表明，使用此方法进行检测时，检测到１０６［］Ｍａｒｃ－ＰＲＲＳＶ后的７２ｈ达１４５细胞感染到调亡最大值。ＴＵＮＥＬ法检测的优越性是，其检测结果可Ｗ将调亡细胞与坏死细胞加Ｗ区别ＵＷ１。在细胞发生调亡时，内源性的ＤＮＡ内切酶被激活，引起ＤＮＡ断裂，而断端的Ｉ３－ＯＨ暴露，与此同时，坏死细胞的ＤＮＡ断裂是无规则的，其中少数细胞也可出现－３３－ １３－ＯＨ的暴露，但数量极小，不易被检测出來，根据细胞调亡的这个特性，在末端脱１，不需要模版就可Ｗ进行３氧核昔酸转移酶的作用下端的脱氧核昔酸的合成，如果在反应系中加入带有特定标记的脱氧核巧酸３’一，则在端就会出现段带有标记物的寡核昔酸一，通过定的显色反应，可特异性的显示发生调亡的细胞，而正常细胞或是正’在增殖过程中的细胞因为几乎没有ＤＮＡ的断裂－，因而没有３０Ｈ形成，故而很少能ｉＭ够被染钮’ｉ气试验结果显示，添加药物的试验组细胞调亡数目明显低于未添加药物的攻毒对照组。说明绿原酸，表告依春Ｗ及淫羊蕾巧可有效的抑制细胞调亡。对于药物抑制轴胞调亡的原因可能是药物在ＰＲＲＳＶ诱导Ｍａｒｃ－１４５细胞发生调亡前就已经将其灭活。已有文献报道ＰＲＲＳＶ５ＴＮＦ－ＪＮＫ，诱导细胞发生调亡与病毒的ＧＰ蛋白ａＷ及、通路ＷＧ－１Ｗ有关。卞合涛等试验发现，绿原酸可Ｗ对体外过氧化氨诱导人厮静脉内皮细胞洞亡起到抑制作用Ｂ－２，表现为细胞调亡率明显减少，线粒体膜电位增加，ｃｌ的表达増强，ＵＷＣａｓａｓｅ－３ｐ的表达减弱。刘哲等体外培养大鼠的间充质干细胞，绿原酸可降低缺氧引起的软骨样细胞调亡率，使得活性氧水平下降，其作用机制可能是降低细胞内的活性氧水平，从而稳定细胞的氧化还原状态来保护线粒体的膜电位，同时促进调亡抑制ＷＳ１基因Ｂｃ－２－ｌ的表达并抑制Ｃａｓｐａｓｅ３的表这。董伟等研究发现，板蓝根中的活性成分能够抑制由ＨＳＶ－１与脂多糖７）（ＬＰＳ）弓胞的组织细胞淋己瘤细胞（Ｕ９３化及小鼠单核巨随细胞（ＲＡＷ２６４．７）的调亡，在２４ｈ内可明显下调因ＬＰＳ作用引起的小鼠ｉｗｆ单核巨隨细胞白血病细胞的忙－１０表达。张奉学等研究发现，用淫羊蕾昔处理被ＳＩＶｍａｃ２５１感染的ＣＥＭＸ１７４细胞可Ｗ有效减缓由ＳＩＶｍａｃ２５１诱导产生的细胞调亡过程有研究指出，ｅｄ淫羊蕾巧能通过促进幼鼠的睾丸间质细胞（Ｌｙｉｇ细胞）的増殖从而降低其调亡，提高幼鼠合成睾厕的功能。３药物抑制ＰＲＲＳＶ的作用机制分析病毒的増殖过程包括对宿主细胞的吸附、侵入、脱壳、病毒基因组复制、病毒蛋白的合成、病毒的组装与释放等。药物对病毒的抑制作用就是针对病毒在宿主细胞内一个或者多个步骤进行干预的复制过程中的某，抑制病毒的增殖，从而阻断病毒对机一体的进步侵入。另外，增强免疫能力也可Ｗ对抵抗病毒侵入起作用。本试验选取了药物直接灭活病毒的方式Ｗ及药物对ＰＲＲＳＶ诱导细胞调ｔ检测的方式对药物抗病毒途径进行分析。试验中将试验药物与病毒液同时加入Ｍａｒｃ－１４５细胞中，进行的细胞免疫化学试－３４－ 验，经过与正常细胞对照组相比较可ｗ发现，表明添加药物绿原酸与表告依春的Ｍａｒｃ－１４５细胞并未感染ＰＲＲＳＶ，但加入淫羊奮巧的试验组却有少数细胞感染了ＰＲＲＳＶ。同时，通过对试验过程中细胞形态的观察发现，绿原酸起到的作用效果最佳，表告依春次之，淫羊藝巧最弱。潘蟹墨等研究发现，绿原酸能够对甲型流感病毒ＦＭ１株起到有效的抑制作用。有研究报道，表告依春具有抗合胞体病毒与甲型流感病毒的。二、０ｍｉｎ作用有研究发现，甘草酸钟苦参碱Ｗ及丹参丽ＩＩＡ可Ｗ在３内将ＰＲＲＳＶｉ直接灭活ｔＷ。已有研究表明，多种中药提取物都可起到直接杀灭病毒的作用，如甘草ＳｔＷ色素ＰＩｆＷＨ结果表明甜素，桑，甘草酸。本试验中的试验，添加药物绿原酸与表告Ｍａｒｃ－依春的１４５细胞并未感染ＰＲＲＳＶ，说明绿原酸与表告依春可能是直接将ＰＲＲＳＶ杀灭，起到了直接灭活病毒的作用；但加入淫羊蕾昔的试验组却有少数细胞感染了ＰＲＲＳＶ，说明淫羊蕾巧对ＰＲＲＳＶ无法起到完全有效的灭活作用。同时，通过对试验过程中细胞形态的观察发现，绿原酸起到的作用效果最佳，表告依春次之，淫羊蕾巧最弱，送可能与绿原酸和表告依春是具有明显抗病毒作用的中药成分，而淫羊蕾昔的主要作用是提高机体免疫力有关。另外，根据细胞免疫化学中对细胞感染部位的定位，在试验中发现ＰＲＲＳＶ大量出现在细胞质中，说明ＰＲＲＳＶ感染细胞的细胞质而非细胞核。ＴＵＮＥＬ法检测细胞调亡的试验结果中，与正常的Ｍａｒｏｌ４５细胞相比较，未发现添加药物绿原酸与表告依春的试验组出现更多的润亡细胞，添加淫羊藝巧的试验姐出一定数量的调亡细胞现来了，同时，攻毒对照组却出现明显的细胞调亡，表明绿原酸一与表告依春可＆有效的抑制细胞调亡，而淫羊蕾昔可Ｗ在定程度上起到抑制细胞调亡的作用。刘哲等研究发现绿原酸可降低缺氧引起的软骨样细胞调ｔ率，促进渦亡抑１Ｂｃ－制基因ｌ２的表达并抑制ＣａｓｐａｓｅＪ的表巧气有研究报道，ＰＲＲＳＶ感染细胞后ｗｎｉ－正－１０会激活产生的信号通路，而板蓝根中的有效成分已证明可Ｗ抑制ＩＬ１０的表ＵＷＳＶ引。达，可能是表告依春抑制由ＰＲＲ起的细胞调亡的机制己有研究表明，淫羊。蕾巧能够増强细胞的免疫功能张奉学等研究发现，淫羊蕾昔可Ｗ有效减缓由猴免疫缺陷病毒（ＳＩＶｍａｃ２５１）诱导产生的细胞调亡过程试验结果说明，沒兰种中药成分可Ｗ不同程度的抑制由ＰＲＲＳＶ引起的细胞调亡，但其具体干扰了ＰＲＲＳＶ诱导细胞一一调亡的哪个途径还需进步研究。－３５－ 结论－本试验通过ＭＴＴ法与细胞病变法确定试验药物对Ｍａｒｃ１４５细胞的安全浓度，并ａｒｃ－且通过琼脂糖凝胶电泳Ｗ及细胞免疫化学的方法确定Ｍ１４５可Ｗ感染ＰＲＲＳＶ，使ａｒｃ－１４５ＴＵＮＥＬ法测定用细胞免疫化学的方法测定ＰＲＲＳＶ对Ｍ细胞的感染情况，用ＰＲＲＳＶ诱导细胞调亡情况：，现得出Ｗ下结论Ｈ种试验药物在Ｍａｒｃ－１绿原酸、表告依春和淫羊蹇昔１４５细胞上均表现具有抗ＰＲＲＳＶ的作用，其中绿原酸的作用效果最好，淫羊蕾昔作用效果最弱。２绿原酸和表告依春可从通过直接灭活ＰＲＲＳＶ从而起到抗病毒效果。３绿原酸、表告依春和淫羊蕾巧Ｈ种试验药物可Ｗ抑制由ＰＲＲＳＶ引起的细胞调亡，淫羊董巧的作用效果较弱。－３６－ 参考文献ｒ＾ＫｅｆａｂｅｒＫＫＬＲｅｐｏｄｕｃｔｉｖｅｆａｉｌｕｒｅｏｆｕｎｋｎｏｗｎｅｔｉｏｌｏ…？Ａｍ．Ａｓｓｏ。ＳｗｉｎｅＰｒａｃｔ．Ｎｅｗｓｌ１９８９［。ｇｙ，，１－：１９．口ｌｂｉｎａＥＬｅｆｏｒｂａｎＹＢａｒｏｎＴ巧ａｌＡｎｅｎｚｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙＥＬＩＳＡｆｏｒｔｈｅ］Ａ，，ｙｍｅ，（）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ化ｅｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＲＲＳ）ｖｉｍＣ－．Ａｌｅｄｔｏｉｉ９２＾（２）６７１ｓｎｎａｓｅｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓｖ６ｔａｒｅｓ．ｌ９：１７６．［］，３Ｂ０ｎｅｒ－ｎｎｏｆｒｃｅｔＡＮｉｅｌｓｅｎＪＢｉｌｌｅＨａｎｓｅＶ．ＩｓｏｌａｔｉｏｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅＰＲＲＳ［］，ｐｏｙ，ｐｐｙ（）ｖｉｒｕｓｉｎ这ＤａｎｉｓｈｓｗｉｎｅｈｅｒｄａｎｄｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｎａｎｔｉｌｔｓｗｉｔｈｔｈｅｉＪ．Ｖｔｒｉｎａｖｒｕｓｅｅｒｐｐｇｇ［］ｙｍ－ｉｃｒｏｂｉｏｌｏ１９９４４０３５１３６０ｇ乂，。）：．＂＂４ＥｄｗＷ－ｒａｒｄｓＳ民ｏｂｅｒｔｓｏｎＩＢｉｌｅｓｍｉｔｈＪｅｔａｌ－ＰＲＲＳｂｌｕｅｅａｒｅｄｉｄｉｓｅａｓｅｉｎＧｅａｔＢｒｉｔａｉｎ－［］，，ｐｇ，（）＾ＡＡ排ｗ－Ｎｅｓｌｅｔｅｒ１９９２４４：３２３６．，，（）ｈａｎＣＣｈｉｍＷＢＬｉｎＭＷｔｌＰｏｒｃｉｒａｉｒｔｏｒｄｒｏｍｅＰＲＲＳｉｎ口］ＣｇＣ，，ｅａ．ｎｅｐｏｄｕｃｔｉｖｅｎｄｒｅｓｐａｓｇ，巧ｙｙｎ（）Ｔ－ａｉｗａｎ．ＬＶｉｒａｌｉｓｏｌａｔｉｏｎ机？ＪＣｈｉｎＳｏｃＶｅｔＳｃｉ１９９３１９４：２６８２７６．，（），［６］ＷｅｎｓｖｏｏｒｔＱＴｅｒｐｓｔｒａＣ，ＰｏｌＪＭＡ，ｅｔａｌ．Ｍｙｓｔｅｒｙｓｗｉｎｅ出ｓｅａｓｅｉｎＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｅｕａｒｔ知－Ｌｅｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓ阴．Ｖｔｅｒｉｎａｒｙｌ，１９９１，１３：１別１３０．Ｑｙ。）７ＣｏｌｌｉｎｓＪＢｅｎｆｉｅｌｄＤＡＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎＷＴｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｓｗｉｎｅｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｙｓｄｒｏｍｅ［］，，，ｙｐｙｎ－ｎｄｎｏｆｖｉｍｓ（ｉｓｏｌａｔｅＡＴＣＣＶＲ２３３巧ｉｎＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａａｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｔｈｅ出ｓｅａｓｅｉｎ巧９２－ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃｐｉ拼［Ｊ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ？，４２：１１７１１２６．］，（）巧］ＴｅｒｐｓｔｒａＣ，ＷｅｎｓｖｏｏｒｔＱＰｏｌＪＭＡ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃａｂｏｒｔｉｏｎａｎｄｎｅｄ＊ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｍｙｓｔｅｒｙｓｗｉｉｓｅａｓｅｂｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈＬｅｌｓｔａｄｖｉｍｓ：Ｋｏｃｈｓｏｓｔｕｌａｔｅｓ（）ｙｙｐＭｆｉｌｌｅｄ…－ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＱｕａｒｔｅｒｌｙ，１９９１，１３。）：１３１－１３６．９郭宝清，陈章水刘文兴等．从疑似ＰＲＲＳ流产胎儿分离ＰＲＲＳＶ的研究化中国畜禽传染病［］，，，－１９９６２１４：．，（）１０ＣｏｎｚｅｌｍａｉｍＫＶｉｓｓｅｒＮＶａｎＷｏｅｎｓｅｌＰｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅ［］，，ｐ吃ｐａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅａｒｔｅｒｉｖｉｍｓｇｒｏｕｐｆＪ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３，１９３（。：３２９－３３９．口１ＭｅｕｌｅｎｂｅｒＪＪＭＨｕｌｓｔＭＭｄｅＭｅｉｅｒＥＪｅｔａｌ．Ｌｅｌｓｔａｄｖｉｍｓｔｈｅｃａｕｓａｔｉｖｅａｅｎｔｏｆｏｒｃｉｎｅ］ｇ，，ｊ，ｙ，ｇｐｅｐｉｄｅｍｉｃａｂｏｒｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅＰＥＡＲｉｓｒｅｌａｔｅｄｔｏＬＤＶａｎｄＥＡＶＪ．Ｖｉｒｏｌｏ１９％ｐｙｙ（巧，［］ｇｙ，，－１９２１：６２７２．（）。２］ＭｕｒｔａｕｇｈＭＰ，ＥｌａｍＭＲ，ＫａｋａｃｈＬＴ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏ凸ｏｆ化ｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＶＲ－２３３２ａｎｄＬｅｖｒｕｓｒｃｈｏｆｖｒｏｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｓｏｆｔｈｅＰＲＲＳｉ…．Ａｉｖｅｓｉｌｏｇｙ１９９５，１４０８：，（）－１４５１１４６０．。３］ＧａｏＺＱ，ＧｕｏＸ，ＹａｎｇＨＣ．Ｇｅｎｏｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ打ｏｆｔｗｏＣｈｉｎｅｓｅｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｏｒｃｉｎｅｒｅｓｉｒａｔｏｒｙｐｐａｎｄｒ－ｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅｓｙｎｄｏｍｅｖｉｍｓＪ，Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｉｒｏｌｏ２００４１４９７：１３４１１３５１．ｐ［］ｖｇｙ，，（）１４高志强．猜繁殖与呼吸综合征病毒全基因组分子遗传特征分析［Ｄ］．北京：中国农业大学２００３．［］，１５ＹｏｓｈｉｉＭＫａｋｕＹＭｕｒａｋａｍｉＹｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎａｎｄｇｅｏｒａｈｉｃｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅ［］，，，ｇｐｐｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｉｎＪａｐａｎＪ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ，２００５，１５０（１１）：［］ｇｙ２３－１３２３２４．口６ＨａｎＪＷａｎＹＦａａｂｅｒＫＳ．ＣｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅａｎａｌｓｉｓｏｆＲＦＬＰ１８４ｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅ］，ｇ，ｇｐｇｙｐｐ－３７－ 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１１２１－９９９３．床病毒学杂志：７５１７９，，（）－７卞益民．．１９９７１：．口，徐晓梅病毒清口服液的制备及其药理学实验研究河北中医９４４４５］口］，，（句狐赵化Ａ元生等．甘草酸钟体外抗猪繁殖与呼吸综合化病毒ＰＲＲＳＶ口引孙，（的活性化中）１２８２－２０３３３２．国兽医学报：２％，，（）５９．苦参碱对ＰＲＲＳＶ的体外抑制作用及其机制Ｊ国兽医学报２０１赵昕，孙娜，白喜云，等，中３［］，，［］－３３６：８０８８１２．（）［６０］ＫａｒｕｐｐａｒｍａｎＡＫ，ＷｕＫＸ，ＱｉａｎｇＪ，幻ａｌ．Ｎａｔｕｒａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｈｉｂｉｔｉ打ｇ化ｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｃｖｅａｎｄｒｓｒａｏｒｓｎｄｒｏｍｅｖＡｎｒｅｓｅａｒｃ２０１２２－１９４ｐｄｕｔｉｅｐｉｔｙｙｉｒｕｓ口？ｔｉｖｉｒａｌｈ，，９４：１８８．］（）［６１］ＫｉｍＹ，ＬｅｅＣ．Ｒｉｂａｖｉｒｉｎｅｆｉｃｉｅ打ｔｌｙｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｐｏｒｃｉ打ｅｎｉｄｏｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ＾］．Ｖｉｒｕｓ化８£过代１１，２０１３，７－１１：４４１）５３．（［６２］ＬｉｕＣ，ＣｈｅｎＨ，ＣｈｅｎＫ，ｅｔａｌ．Ｓｕｌｆａｔｅｄｍｏｄｉ打ｃａｔｉｏ打ｃａｎｅｎｈａｎｃｅａｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓｂｉｄｅｎ１；ａｔ；ａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｇａｉｎｓｔｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｍｓＰＲＲＳＶｉｎｐ（）－ｖｉｔｒｏ．虹ｔｅｍａｔｉｏｎａｌｏｕｒｎａｌｏｆｏｏｃａｍａｃｒｏｍｏｅｃｕｅｓ１３１２４口］ｂｉｌｇｉｌｌｌ２０５２：２．，，ｊ６３ＩｎＭｂｉｔｉｏ打ｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅｖｉｍｓｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｂｆｌａｖａｓｐｉｄｉｃａｃｉｄＡＢ［］ｐｙｙｐｙｎｉｖｒａｒｅｓ－Ｊ．１１７３．．ａｔｉｌ２０３９７：６６，，［］（）［６４］Ｌｕｏ民，ＦａｎｇＬ，ＪｉｎＨ，ｅｔａｌ．ＡｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｙｐｅＩａｎｄｔｙｐｅＩＩＩｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓａｇａｉｎｓｔｏｒｃｉｎｅｐ－ｒｅｒｏ加ｃｔｉｖｅａｎｄＫｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓＰＲＲＳＶＪ．Ａｎｔｖｒａｒｅｓｅａｒｃ２１１．ｐｐｙｙｉｉｌｈ２０１１９１：９９０，，（）［］（）［６５］Ｍａｔｅｕｓｅ打Ｂ，ＭａｅｓＤ，Ｈｏ幻ａｃｋＧｅｔａｌ．Ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｆ１；ｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅｕｓｅｏｆｔｉｌｍｉｃｏｓｉｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｐｕｌｍｏｔｉｌｐｒｅｍｉｘ？）ａｎｄＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｖａｃｃｉｎａｔｉｏ打ｉ打ａｐｉｇｈｅｒｄｗｉ化ｃｈｒｏｎｉｃ－ｒｅｓｉｒａｔｏｒｄｉｓｅａｓｅＪ．ＪｏｕｒｎａｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｅｄｃ打ｅｅｓＢ２００１４１３７４１．ｐｙｌＭｉｉＳｅｒｉ８０：７３［］ｙ，，，（）ａｅｒｅ民Ｅ－－６６ＣｒｔＬＣｕｒｉｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１２Ｌ１２ａｍｅｌｓｓｒａｏｒａｎｄｉｏｒａｔｅ也ｅｅｆｅｃ化ｏｆｏｒｃｉｎｅｒｅｉｔ，ｐ［］ＱＵ）ｐｙｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓＰＲＲＳＶ＾ｎｆｅｃｔｉｏｎＪ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉｍｍｕｎｏｌｏａｎｄｉｍｍｕｎｏａ化ｏｌｏ（）［］ｙｇｙｐｇｙ，２００５１０７１－：１０１１，（）５８．６７ＹＦａｎＬＬｕｏ民ａｌ－ａｃｅｅｎｃａｍＪｉａｎｉｎｅｎｈｓｅｒｅｃａｏｎｏｆｏｒｃｎｅｒｅｒｏｃｖｅ巧．Ｎｔｌｉｉｌｌｉｉｂｉｔｔｈｌｉｔｉｉｄｕｔｉ［］ｇ，ｇ，，ｙｐｐｐｐａｎｄｒｅｓｒａｏｒｓｎｄｒｏｍｅｉ－．２０１０７７６１７．ｐｉｔｙｙｖｉｒｕｓｎｖｉｔｒｏＪＶｅｔｅｒｉｎａｒｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ３４：６０［］ｙ，，（）［６８］ＨｅＹ，Ｈｕａ民，ＺｈｏｕＹ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ－ｎ－ｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｏｎＭＡＲＣ１４５ｃｅｌｌｓｕｓｉＤＮＡｂａｓｅｄｓｈｏｒｔｎｅｒｆｅｎＲＮＡｓＪ．Ａｎｖｒａｒｅｓｅａｒｃｐｇｉｔｒｉｇｔｉｉｌｈ２００７，，［］７４２－：８３９１．（）６９Ｌｉ过ｎｇＰＬｉＹｅｔａ．ＩｉｖｅａｎｄｒｅｓＧｌｎｈ化ｉｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｒｅｌｉｃａｔｉ，，ｏｎ［］ｐｐｐｙｙｐｂａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄＲｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｔｆｉｎｏｒｃｉｎｅａｌｖｅｏｙＮＡｉｎｔｂｉｐｌａｒｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｓｗｉｎｅＪ．［］Ａｎｔｉｖｉｒａ－ｌｒｅｓｅａｒｃｈ２００９８２３１１：５７６５．，，（）［７０］ＨａｏＸ，ＳｈｅｎＺ，ＷａｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｔｒｏｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓａ打ｄｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｍｓｂｓｌｉｈｔｌａｃｉｄｉｃｅｌｅｃｒｏｌｚｅｄｗａｔｅｒ．ＴｈｅＶｅｅｒｉｎａｒＪｏｕｒｎａｌ２０１３ｙｇｙｔｙ口］ｔｙ，，２２９７－３０１９７（）：１．－７１．．９９４２５１２李铁瞬：６５５６５８．，梁再赋甘草提取物及其衍生物的抗病毒研究现状饥中草药，１［］，（）－７．中成药２００５２７１１１１．：６１９［句张其咏张楚瑜抗病毒中药研究的最新进展机，，（）Ｔ７３ＧｒａｖｉｎａＨＤａｆｕｒｉＮＦＪｕｎｉｏｒＡＳｅｔａ．Ｉｎｖｉｏａｓｓｅｓｓｍｅｎｏｆａｎｖｒａｏｅｎａｏｆｌｔｒｔｔｈｅｔｉｉｌｔｔｉｌ［］，，，ｐ－ｔｒａｎｓｃｉｎｎａｍ过ｃｕｅｒｃｅｎｉ？ｉｃｉｄｔｉａｎｄｍｏｒｉｎａａｉｎｓｔｅｕｉｄｈｅｒｅｓｖｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈｉｎｖｅｔｅｒｉｎａｒｓｃｉｅｎｃｅ，ｑｇｑｐ口，］ｙ－２０１１９１３：１５８１６２．，（）４ＷａｎＪ，Ｃｈｅ打Ｘ，ＷａｎＷｅｔａｌ．Ｇｌｃｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄａｓｔｈｅａ打ｔｉｖｉｒａｌｃｏｍｏ打ｅｎｔｏｆＧｌｙｃｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅ打ｓｉｓ１７］ｇｇ，ｙｙｐｙＦｓｃａａｉｎｓｃｏｘｓａｃｋｅｖｒｕｓａ打ｄｎｅｒｏｖｒｕｓ１ｏｓｅａｓｅ．ｕｒｎａｉｈ．ｇｔｉｉＡｌ６ｅｔｉ７ｆｈａｎｄｆｏｏｔａ打ｄｍｏｕ化ｄｉＪＪｏｌｏｆ［］－４０－ 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致谢时光甚巧，光阴如梭。Ｈ年的研究生生活马上就要在这个绿意盎然的六月结束了，一，等待我的又将是人生中段新的开始。这Ｈ年的求学生涯中，有收获也有遗憾有意气风发也有怅然若失，虽然辛苦却也收获满囊。我的求学生涯离不开师长与亲友的支持，，我。不仅因为您在我，我要感谢的人有许多但首先要感谢我的导师贺俊平教授论文完成过程中从选题到实验，再到论文的写作都给予我悉也教导，每个环节都倾尽也血，而且您严谨的治学态度，渊博的知识水平，诚恳的待人方式，都为我树立了良好的榜样，必将使我受益终生。一感谢实验室董常生教授给我们提供了流的实验条件，舒适的学习环境让我们的实验能够顺利完成。感谢实验室赫晚燕老师，王海，，耿建军老师，范瑞文老师东老师于秀菊老师对我的指导、鼓励和关也。感谢实验室的同窗好友庞亚妙，申艳，张丹逵，张秋月，，张县，石占全，姬凯元对我的帮助和支持。特别感谢我的师弟梁亚俊师妹一范小瑞一，跟你们在起的日子，我感受到了家人样的陪伴。感谢实验室的师兄师姐Ｗ及师弟师妹，，还有其他我未曾列举，给我莫大的帮助与鼓励的人在此表示由衷的感谢一。感谢父母的路支持与包容，使我安也求学。最后！，再次感谢所有对我有过帮助与支持的人，谢谢么Ｖ５卑６巧－４９－