12-脂氧化酶对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响

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12-脂氧化酶对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响Theeffectof12-lipoxygenaseoninsulinresistanceintype2diabeticrat作者姓名：李明领域（方向）：临床医学指导教师：许钟镐教授类别：临床医学硕士答辩日期：2015年6月2日 前言2013年中国糖尿病患者居全球首位，约1/3的糖尿病患者可发展为糖尿病肾病（Diabeticnephropathy，DN），而DN是导致终末期肾脏病（Endstagerenaldisease，ESRD）最常见的原因之一。DN发病率的逐年上升，给社会带来了极为沉重的负担，因此，DN的发病机制、诊断和治疗已经成为近年来的研究热点。12-脂氧化酶(12-Lipoxygenase，12-LO)有3种类型：血小板型、白细胞型和表皮型。其中白细胞型12-LO与人、兔15-LO高度同源，合称为12/15-LO。白细胞型12-LO分布在多种不同的细胞和组织中，包括肾上腺细胞、血管平滑肌细胞、脑、肾脏和胰腺。研究证实12-LO可以通过诱发炎症级联反应和氧化应激反应参与多种疾病的发生、发展，如糖尿病、动脉粥样硬化以及神经系统疾病等。抑制12-LO不仅降低2型糖尿病肾小球内血管紧张素Ⅱ1型受体（AngiotensinⅡtype1receptor，AT1R）的表达，而且延缓微量白蛋白尿（Microalbunminuria，MAU）进展。12-LO可以促进胰岛素抵抗（Insulinresistance，IR）的病理生理过程，而IR贯穿于2型糖尿病发生、发展。那么12-LO能否通过影响IR，从而参与MAU发生、发展，对此还未见相关报道。本研究选择空腹胰岛素水平、胰岛素敏感指数及腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）为评价IR的指标，首次探讨2型糖尿病时12-LO对IR的影响，为抑制12-LO来延缓DN蛋白尿提供了理论依据。I 中文摘要12-脂氧化酶对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响目的：探讨2型糖尿病时12脂氧化酶（12-LO）对胰岛素抵抗（IR）的影响。-7方法：用12-LO代谢产物（12(S)-HETE，10mol/L）和胰岛素-6(10mol/L)刺激小鼠足细胞。选取清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，采用高脂饮食饲养6周，之后用小剂量链脲佐菌素（STZ，35mg/kg，腹腔注射）制备2型糖尿病模型。模型成功后，将大鼠随机分成普通饮食对照组（Ctrl组）、2型糖尿病组（DN组）、2型糖尿病+CDC（12-LO抑制剂，8mg/kg，3次/周，连续皮下注射8周）处理组（CDC组）。实验结束前留取24小时尿，测血糖、称重，2%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，心脏取血，取出右肾称重，取右侧大腿骨骼肌在-70℃保存。本实验选择空腹胰岛素水平、胰岛素敏感指数(ISI=1/[空腹血糖×空腹胰岛素]，取其自然对数使之正态化后进行分析)及腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）为评价IR的指标。采用Westernblot和ELISA法检测相应指标。结果：与对照组相比，12(S)-HETE和胰岛素均可以诱导足细胞AT1受体蛋白表达增加（P<0.01），足细胞在12(S)-HETE和胰岛素联合刺激下AT1受体表达较12(S)-HETE组和胰岛素组增加（P<0.05）。CDC对2型糖尿病大鼠血糖水平影响不明显，但可减少肾重/体重和微量白蛋白尿，降低空腹胰岛素水平，升高胰岛素敏感指数，恢复p-AMPK至正常水平，与DN组相比有统计学意义(P<0.05)。II 结论：12-LO与2型糖尿病IR的发生有关，12-LO可能通过影响IR的途径作用于2型糖尿病肾病蛋白尿的进展。关键词：12-脂氧化酶，2型糖尿病，胰岛素抵抗，糖尿病肾病，血管紧张素Ⅱ1型受体III ABSTRACTTheeffectof12-lipoxygenaseoninsulinresistanceintype2diabeticratObjective：Toinvestigatetheeffectof12-lipoxygenase(12-LO)oninsulinresistance(IR)intype2diabeticrat.-7Methods：Podocyteswerestimulatedby12(S)-HETE(10mol/L)-6or/andinsulin(10mol/L)for24hours.Ratsfedhighfatdietwerereceivedlowdosestreptozotocin(STZ,35mg/kg,intraperitonealinjection)tomaketype2diabetesanddividedinto2groups:lowdoseSTZ(DNgroup),lowdoseSTZ+12-LOinhibitorcinnamyl-3,4-dihydroxy-cynanocinnamate(CDC,8mg/kg)(CDCgroup).Ratsfedregularchowwereascontrolgroup(Ctrlgroup).TheratsreceivedinjectionofCDCorvehiclesubcutaneouslyinthehindlegs．CDCorvehicleinjectionwasperformedthreetimesaweek.Allratsweresacrificedafter8weeks.Urine,blood,kidneyandskeletalmusclefromrathindlegswerecollectedattheendofstudyrespectively.Theleveloffastingseruminsulin,insulinsensitivityindexandAMPKweredesignedassymbolsforIR.ELISAandWesternblotforrelatedtargetswereperformedrespectively.Results：12(S)-HETEandinsulinincreasedangiotensinⅡtype1receptor(AT1R)levelsinpodocytes,respectively(P<0.01)．AT1Rlevelsweresignificantlyincreasedbythecombinedstimulationof12(S)-HETEandinsulin.Bloodglucose(P<0.05),kidney/bodyweight(P<0.01)andurineprotein(P<0.01)wereincreasedinDNgroupcomparedwithCtrlgroup.However,urineprotein(P<0.05)，Kidney/bodyweight(P<0.05)weredecreasedinCDCgroupcomparedwithDNgroup.ThereIV wasnochangeinbloodglucoselevelbetweenCDCgroupandDNgroup.Incrementoffastingseruminsulin(P<0.01)anddecrementofp-AMPK(P<0.01)andinsulinsensitivityindex(P<0.01)wereobservedinDNgroupcomparedwithCtrlgroup.However,theabnormalitiesweresignificantlyamelioratedafterCDCtreatment.Conclusion：12-LOaffectsthedevelopmentofproteinuriaintype2diabeticnephropathyviaIRthatrelativetoAT1Rproteinexpression.Keywords：12-Lipoxygenase，Type2diabetesmellitus，Insulinresistance，Diabeticnephropathy;，AngiotensinⅡtype1receptorV 目录第1章综述.........................................................................................11.112-脂氧化酶与糖尿病肾病...........................................................11.212-脂氧化酶在糖尿病肾病进展中对血管紧张素Ⅱ1型受体的作用..................................................................................................21.312-脂氧化酶在糖尿病肾病进展中对胰岛素抵抗的影响...........31.412-脂氧化酶与AngⅡ1型受体和胰岛素抵抗在糖尿病肾病进展中的相互作用.........................................................................4第2章材料与方法................................................................................62.1实验材料.........................................................................................62.1.1细胞及动物..............................................................................62.1.2主要实验试剂..........................................................................62.1.3主要仪器..................................................................................72.2实验方法.........................................................................................72.2.1足细胞实验..............................................................................72.2.2动物实验..................................................................................92.2.3统计学处理............................................................................13第3章结果.......................................................................................143.1细胞实验结果..............................................................................143.2动物一般情况分析......................................................................153.312-LO对空腹胰岛素水平及胰岛素敏感指数的影响.............153.412-LO对AMPK的影响............................................................16第4章讨论.......................................................................................17第5章结论.......................................................................................20参考文献...................................................................................................21作者简介及在学期间所取得的科研成果..............................................27致谢...................................................................................................28VI 中英文及缩写对照表英文缩写英文全称中文全称DNDiabeticnephropathy糖尿病肾病12-LO12-Lipoxygenase12-脂氧化酶IRInsulinresistance胰岛素抵抗FINSFastingseruminsulin空腹胰岛素水平ISIInsulinsensitivityindex胰岛素敏感指数AMPKAMP-activatedproteinkinase腺苷酸活化蛋白激酶p-AMPKPhos-AMP-activatedproteinkinase磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶MAUMicroalbuminuria微量白蛋白尿STZStreptozotocin链脲佐菌素ESRDEndstagerenaldisease终末期肾病RASRenin-angiotensinsystem肾素-血管紧张素系统HETEHydroxyeicosatetraenoicacid氢氧化二十碳四烯酸AngⅠAngiotensinⅠ血管紧张素ⅠAngⅡAngiotensinⅡ血管紧张素ⅡAT1RAngiotensinⅡtype1receptor血管紧张素Ⅱ1型受体VII 第1章综述糖尿病肾病(Diabeticnephropathy,DN)是导致慢性肾功能不全的主要原因之一。目前，慢性肾功能不全患者中DN所占比例在西方发达国家已达30％～40％，其中由2型糖尿病引起的病例达到80％以上，在我国其发病人数也迅速增长。一系列研究发现2型DN的进展与肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensinsystem,RAS）的激活和胰岛素抵抗（Insulinresistance,IR）密切相关。1.112-脂氧化酶与糖尿病肾病脂氧化酶（Lipoxygenase，LO）有3种类型：血小板型、白细胞型和表皮型。根据氧分子位置的不同，LO可分为5-、8-、12-、15-LO，以花生四烯酸为基质生成相应的氢氧化二十碳四烯酸（Hydroxyeicosatetraenoicacid，HETE）。研究证实，白细胞型12-LO及其主要作用产物12(S)-HETE参与动脉粥样硬化、冠心病、高血压、糖尿病等多种疾病的发生、发展。研究发现12-LO基因和蛋白水平在高糖刺激的肾小球系膜细胞、足细胞和糖尿病肾小球内的表达均显著增加，而通过应用基因沉默、药物性抑制剂等方法降低肾小球细胞内12-LO的表达能够明显降低高糖刺激诱导的细胞外基质的积聚及肾[5-11]小球细胞肥大。12-LO主要通过p38MAPK信号通路引起肾小球[9-11]细胞纤维化和细胞外基质积聚。最近，Xu等通过动物实验发现，抑制12-LO不仅降低2型糖尿病肾小球内血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）1型受体（AT1R）mRNA和蛋白的表达，而且可延缓蛋白尿的进展，[5]由此证实12-LO加速DN进展的另一个重要机制。1 1.212-脂氧化酶在糖尿病肾病进展中对血管紧张素Ⅱ1型受体的作用DN的发生、发展与RAS的激活有密切的关系。传统RAS包括肾素、血管紧张素原、血管紧张素Ⅰ（AngiotensinⅠ，AngⅠ）、血管紧张素转化酶、血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）和AngⅡ受体。血管紧张素原在肾素的作用下生成AngⅠ，后者无特殊效应，但经血管紧张素转化酶作用后，则成为极具生物活性的八肽即AngⅡ。AngⅡ是RAS中最重要的效应分子，它主要通过两种受体，即AngⅡ1型受体（AT1R）和AngⅡ2型受体（AT2R）发挥作用。AT2R的作用常常表现为对抗AT1R。因此，AT1R介导了几乎所有的AngⅡ的经典作用。DN时肾小球内AngⅡ的生成增加，AngⅡ通过与AT1R结合，导致AT1R兴奋，进而激活一系列信号转导通路，通过压力依赖性和/或非压力依赖性途径参与DN的进展。研究证实AT1R的表达受到很多因子的调节，并且AT1R水平上[4,5,29,34-36]调可使AngⅡ的作用增强，反之亦然。利用肾小球细胞及血管平滑肌细胞的invitro研究发现高糖、胰岛素等均能诱导AT1R的[29,31,33,36,37]表达增加，但持续的AngⅡ的刺激却降低AT1R的表达。Xu等的研究发现白细胞型12-LO及其主要作用产物12(S)-HETE在[4,5,10,11,29]DN进展中的作用与AngⅡ相似，但AngⅡ和12(S)-HETE在[4,5,29,31-33]对调控AT1R表达过程中起到不同的作用。Xu等的研究不仅发现激活12-LO—12(S)-HETE通路可以上调肾小球细胞及肾小球内AT1R蛋白表达，而且进一步明确了抑制12-LO能够下调AT1R的表[4,5,29]达进而减弱AngⅡ的效应。2 1.312-脂氧化酶在糖尿病肾病进展中对胰岛素抵抗的影响IR是1型和2型糖尿病的重要区别所在，其临床特征表现为高胰岛素血症。研究证明，在血压正常的2型糖尿病患者中，IR是微[1-3]量白蛋白尿（Microalbuminuria，MAU）的独立危险因素。肥胖Zucker大鼠是理想的IR动物模型。Xu等的研究发现，在血压和血糖无明显差异的年轻肥胖Zucker大鼠与瘦Zucker大鼠比较，年轻肥胖[4]Zucker大鼠的MAU明显增加，从而证明单纯高胰岛素血症引起MAU的可能性。研究表明各种生长因子、细胞因子和脂质调节物质均与IR有关。值得引起注意的是，Xu等在研究过程中不仅发现白细[4]胞型12-LO在年轻肥胖Zucker大鼠肾组织内的表达增加，而且在[5-6]伴有IR的2型DN肾小球内的表达同样增加，由此推测12-LO可能与IR及与其相关的2型DN的发生、发展有关。众所周知，IR作为MAU的独立危险因素，是引起2型糖尿病高血糖的直接原因。2型糖尿病合并MAU的患者可能在发生糖尿病之[12,13]前就存在IR，其逐渐引起肾脏发生病理生理改变，而导致MAU。IR影响MAU的原因与以下因素有关:在IR状态下，高胰岛素血症可[14]以使白蛋白滤过增多；胰岛素可以减少白蛋白重吸收，增加尿白蛋[14]白排出。更重要的是，在IR状态下，高胰岛素血症和胰岛素介导的扩张血管作用减弱可以导致肾小球血流量增加，肾小球处于高灌注[14]状态，使MAU排出增多。与完全依赖胰岛素治疗的1型糖尿病不同，在治疗2型糖尿病时可以通过干扰IR而影响高血糖和/或高胰岛素血症，从而延缓糖尿病合并症的发生、发展。研究表明，12-LO在[6-11]DN时肾小球硬化过程中的作用及其机制已基本清楚。然而，12-LO对IR和蛋白尿的影响及其机制尚不清楚。3 最近，Xu等利用已公认的高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素[15]（Streptozotocin，STZ）诱导的2型糖尿病动物模型在国际上首次[5]证实了抑制12-LO可以延缓2型糖尿病大鼠MAU的进展。然而，另一项利用大剂量STZ诱导的1型糖尿病动物模型的研究表明抑制[16]12-LO不能延缓MAU的进展。上述研究分别应用不同类型的糖尿病模型得到了不同的结果，即12-LO与2型DN时MAU的发生、发展有关，而与1型DN时MAU的发生、发展无关。众所周知，1型和2型糖尿病的重要区别是IR。我们有理由设想12-LO可能通过影响IR的途径作用于蛋白尿的发生、发展。IR、胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病的主要病因，其中IR贯穿于2型糖尿病发生、发展的整个过程。其实，一些研究已为糖尿病时抑制12-LO来直接保护胰岛[17-19]β细胞而延缓血糖升高的设想提供了线索。1.412-脂氧化酶与AngⅡ1型受体和胰岛素抵抗在糖尿病肾病进展中的相互作用Xu等在研究过程中发现AT1R在与IR有关的2型糖尿病肾小球[5,20-23]内表达增加，但以往的研究明AT1R在与IR无关的1型糖尿病[24-28]肾小球内表达无增加。Xu等的进一步研究发现抑制12-LO不仅[5]降低2型糖尿病肾小球内AT1R的表达，而且延缓MAU进展。然而，Xu等的前期研究发现抑制12-LO对1型糖尿病肾小球内AT1R的表达及MAU的进展无影响。利用肾小球细胞及血管平滑肌细胞的体外研究发现高糖、12-LO、胰岛素均能诱导AT1R的表达增加，但[5,29-33]持续的AngⅡ的刺激降低AT1R的表达。从高糖、12-LO、AngⅡ、胰岛素对AT1R影响的角度考虑，不难得出它们之间的这种动态平衡是决定肾小球内AT1R水平的重要结论，其中高胰岛素血症可能4 是在这个体系中决定1型和2型糖尿病肾小球内AT1R表达变化的关键因素。通过AT1R只在2型DN肾小球内表达增加、抑制12-LO只降低2型DN时肾小球内AT1R表达及MAU的研究结果，并结合高胰岛素血症是区别1型和2型糖尿病的重要临床特征的特点，我们设想2型DN时12-LO和IR的相互作用所诱导的肾小球内AT1R的表达增加是促进MAU发生、发展的重要原因。总之，12-LO激活与2型DN肾小球内AT1R增加有着密切相关，抑制12-LO可能通过抑制IR降低2型DN时肾小球内AT1R表达，从而延缓MAU的进展。然而，目前对2型DN时12-LO抑制IR的机制尚不清楚。5 第2章材料与方法2.1实验材料2.1.1细胞及动物2.1.1.1实验细胞足细胞系在33℃有γ-干扰素时，细胞具有无限增殖的特性；在37℃无γ-干扰素时，细胞失去增殖能力而趋于分化成熟。2.1.1.2实验大鼠体重为180-200g。清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，在吉林大学动物实验中心购买并饲养，饲养条件：大鼠4只/笼，饲养温度20±2℃，相对湿度60±5%，实验期间自由进食水。2.1.2主要实验试剂AMPK抗体美国SantaCruz公司p-AMPK抗体美国SantaCruz公司AT1R抗体美国SantaCruz公司β-actin抗体美国SantaCruz公司链脲佐菌素（STZ）美国Sigma公司Cinnamyl-3,4-dihydroxy-α-cynanocinnamate（CDC）美国Biomol公司尿白蛋白ELISA试剂盒美国ExocellInc.胰岛素放射免疫试剂盒美国Linco公司RPMI1640培养基美国Gibco公司胎牛血清（PBS）美国Gibco公司γ-干扰素美国Sigma公司Ⅰ型胶原蛋白美国Sigma公司12(S)-HETE美国Biomol公司胰岛素美国Sigma公司6 2.1.3主要仪器血糖仪、血糖试纸条德国罗氏(ROCHE)诊断公司代谢笼吉林大学动物实验中心旋涡振荡器海门市其林贝尔仪器制造有限公司电子天平美国OHAUS公司Star-fax2100酶标仪广州倍信公司JS-380A自动凝胶图像分析仪上海培清科技有限公司标准型pH计北京赛多利斯有限公司BCN-1360型生物洁净工作操作台北京东联哈尔仪器制造有限公司IEC高速低温离心机美国Thermo公司DYY-8C电泳仪北京市六一仪器厂电泳槽美国Bio-rad公司蛋白转膜仪美国Bio-rad公司移液器德国Eppendorf公司CO2细胞培养箱美国Thermo公司倒置显微镜日本Olympus公司4℃、-20℃冰箱中国海尔公司-80℃冰箱美国Thermo公司恒温箱哈尔滨科学器材厂2.2实验方法2.2.1足细胞实验2.2.1.1足细胞培养将液氮中冻存的足细胞迅速取出，于37℃水浴中摇晃，使之在1分钟内迅速溶解。超净台上，将细胞移入5ml含lO％FBS的RPMI1640培养液中，1200转／分钟离心5分钟，倒掉含DMS0的上清。加入含10%FBS7 RPMI1640培养液5ml，加样枪反复吹打至细胞呈单个，将其移入培养瓶。加入50U/mlγ-干扰素，放入33℃、5％CO2培养箱中培养，2天换1次培养液。待细胞长至80％以上时将细胞培养瓶中的培养液吸去，PBS洗涤细胞两次，弃掉洗涤液，加入0.25％胰蛋白酶2ml，摇动培养瓶。置于37℃培养箱中3分钟，直至在倒置显微镜下发现细胞间隙增大，回缩变圆，甚至有些细胞从瓶底脱落，立即用10％FBS的RPMI1640培养液终止消化，用吸管反复吹打底部使足细胞脱落。将含细胞的培养液移入离心管中，1200转/分钟离心5分钟，弃上清。加入含lO％FBSRPMI1640培养液5ml，轻柔吹打至细胞呈单个，以1：2分瓶培养。将传代的足细胞移人不含γ-干扰素的培养液中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。分化14天，细胞生长至亚融合状态时，更换为无血清培养液使细胞同步化48小时。足细胞分为对照组，胰岛素处理组，12(S)-HETE处理组和胰岛素+12(S)-HETE处-6-7理组。用胰岛素(10mol/L)和/或12(S)-HETE(10mol/L)处理足细胞24小时。2.2.1.2WesternBlot测定蛋白表达（1）提取总蛋白：将有足细胞的培养皿洗涤后弃去洗液，置于冰上，用裂解液裂解细胞。充分吹打至细胞散开，冰浴30分钟。12000转/分钟，4℃，离心30分钟，将上清转移至新的EP管。（2）BCA法测蛋白浓度：配制BCA工作液，A液与B液体积比为50:1，按1:50稀释待测蛋白。设2个复孔，每个孔加入BCA工作液200μL；每孔加入待测蛋白和标准蛋白25μL，37℃孵育2小时；酶标仪读数并计算蛋白浓度。（3）变性蛋白：按每个加样孔50μg量计算出样本蛋白体积，加入RIPA配至等体积，再加入相同体积的2×SDS。95℃水浴5分8 钟后置于冰上15分钟，-20℃保存，以备电泳用。（4）制备聚丙烯酰胺凝胶：根据目的蛋白的分子量大小选择分离胶浓度，本实验制备10%的分离胶。（5）加样电泳：将制好的胶放入电泳仪夹紧，加入电泳液，不漏后拔出梳子，加样。先用低压50V电泳，待样品电泳至分离胶时，将电压调节至100V。（6）转膜：剪6块滤纸和1块PVDF膜，其大小与SDS凝胶大小相同。使用前，放入转膜液中平衡10分钟。看好转膜槽的正负极，按顺序放好：3块滤纸→SDS凝胶→PVDF膜→3块滤纸；于半干转膜槽中转膜约1小时。取出转印膜，并在膜上剪一小角标明上下方向。（7）丽春红染色：用丽春红泡PVDF膜，至膜上出现条带即可，根据蛋白分子量剪取PVDF膜，然后将PVDF膜放入去离子水中清洗。将膜放入封闭袋中，加入封闭液，封闭约2小时。（8）加抗体：在封闭液中加入一抗，AT1R一抗比例为1:1000，β-actin一抗比例为1:5000。4℃震荡过夜。TBST洗膜3×10分钟。加二抗（1:2000）进行杂交，室温下反应1.5小时，TBST洗膜3×10分钟。（9）显影：将PVDF膜置于暗夹内，表面涂匀ECL发光剂，室温下反应1-2分钟，用滤纸吸干PVDF膜上的水分，在暗室进行显影。2.2.2动物实验2.2.2.1分组及处理本研究采用高脂饮食诱发大鼠产生高胰岛素血症和IR,再通过注射小剂量STZ导致胰腺代偿性分泌胰岛素功能障碍,最后诱发2型糖尿病。清洁级健康雄性SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为2组。9 对照组（Ctrl组，N=10）和高脂饮食组（N=20）。饲养6周后，高脂饮食组腹腔注射小剂量STZ（35mg/kg）制备2型糖尿病模型；对照组大鼠腹腔注射等体积枸橼酸盐缓冲液。给药前12小时禁食不禁水。STZ注射3天后，尾静脉采血检测大鼠空腹血糖，以血糖>300mg/dL为模型成功的标准，未达到标准的大鼠被排除实验。糖尿病模型诱导成功后将糖尿病组大鼠随机分为两组：高脂饮食结合小剂量STZ诱导2型糖尿病组(DN组，N=9)、高脂饮食结合小剂量STZ诱导2型糖尿病+CDC(12-LO抑制剂)处理组(CDC组，N=9)，CDC组大鼠连续皮下注射CDC(8mg/kg，3次/周)8周。8周后处死动物。实验结束前留取24小时尿，测血糖，称重。2%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，心脏取血，取出右肾称重，取右侧大腿骨骼肌在-70℃保存。2.2.2.2标本采集（1）尿标本：用代谢笼收集大鼠24小时尿。分别记录下各组各只大鼠的24小时尿量。将收集的24小时鼠尿摇匀后取出3ml在2500转/分钟，4℃条件下离心l0分钟，取上清液置于离心管中，-20℃保存。（2）血标本：尾静脉采血，采用血糖仪检测大鼠空腹血糖；大鼠麻醉后，心脏取血，在3000转/分钟4℃条件下离心10分钟，分离血清，-80℃冻存。（3）骨骼肌标本：麻醉后取大鼠右侧大腿骨骼肌于-70℃保存，进行WesternBlot检测。2.2.2.3指标检测方法2.2.2.3.1ELISA测定尿微量白蛋白从-20℃冰箱取出收集的尿液，用ELISA试剂盒检测尿微量白蛋10 白：（1）加样：设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，加样将样品加于酶标板孔底部，晃动混匀之后酶标板覆膜，37℃条件下反应120分钟。（2）弃去液体并甩干。每孔加生物素标记抗体工作液100μl，37℃反应60分钟。（3）60分钟后，倾倒孔内液体并甩干，洗板3次，每次浸泡1分钟，350μl/每孔，甩干。（4）每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。（5）温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。（6）每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色。（7）每孔加终止液50μl，终止反应。（8）加终止液。15分钟以内用酶联仪测量各孔的光密度（OD值）。2.2.2.3.2放射免疫法测定空腹胰岛素水平采用均相竞争抑制原理对血清进行直接测定。标准或样品中的胰125岛素和I标记的胰岛素共同与特异性抗体进行竞争性免疫反应。用免疫分离剂分离出抗原-抗体复合物，并测定结合物中的放射性。（1）取试管编号NSB、S0～S5和待测样品管等，用加样器按下表加样（加样前所有试剂摇匀）。11 管别NSB总TS0S1-S5样品试剂胰岛素缓冲液200-100--胰岛素抗体--100100100125I-胰岛素100100100100100胰岛素标准品---100-待测样品----100注：单位为μl（2）加样后混匀，37℃温育2小时。（3）各试管内加入免疫分离剂500μl，摇匀，室温放置15分钟。（4）使用离心机3500转/分钟离心15分钟，吸取上清液并弃之。测各管沉淀的放射性计数。（5）计算机处理得出空腹胰岛素水平。2.2.2.3.3WesternBlot测定蛋白表达从-80℃冰箱取出冻存的骨骼肌，进行WesternBlot检测。具体方法同上2.2.1.2。本实验制备12%的分离胶。p-AMPK和AMPK一抗比例为1:1000，二抗比例为（1:5000）。2.2.3.3.4肾重/体重测定处死动物前称量仪测量体重。麻醉后取出右肾称重并计算肾重/体重。2.2.3.3.5胰岛素敏感指数测定胰岛素敏感指数采取公式ISI=1/[空腹血糖×空腹胰岛素],取其自然对数使之正态化后进行分析。12 2.2.3统计学处理数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，两组以上比较采用ANOVA检验，P<0.05有统计学意义。13 第3章结果3.1细胞实验结果结果表明与对照组足细胞相比，12(S)-HETE和胰岛素均可以诱导足细胞AT1R蛋白表达明显增加（P<0.01），足细胞在12(S)-HETE和胰岛素联合刺激下AT1R蛋白表达较12(S)-HETE组和胰岛素组增加（P<0.05），见图3.1。图3.1小鼠足细胞中AT1R的表达注：与对照组足细胞相比，12(S)-HETE刺激组和胰岛素刺激组的AT1R表达明显增高。与12(S)-HETE刺激组和胰岛素刺激组相比，12(S)-HETE+胰岛素刺激*组的AT1R表达增高。与对照组相比，P<0.01；与12(S)-HETE+胰岛素刺激组相#比，P<0.05。14 3.2动物一般情况分析与Ctrl组比较，DN组和CDC组血糖明显增高（P<0.01），但DN组和CDC组之间无差异,见表3.2。与Ctrl组比较,DN组肾重/体重明显增高（P<0.01），CDC治疗明显降低肾重/体重（P<0.05）,见表3.2。与Ctrl组比较,DN组大鼠MAU明显增高（P<0.01），CDC治疗明显地降低MAU（P<0.05），见表3.2。表3.2各组大鼠生理指标变化情况（x±s）CtrlDNCDC**血糖(mg/dL)99.6±5.1312.3±9.2319.50±13.1*#肾重/体重(mg/g)3.09±0.215.01±0.323.41±0.25*#24h尿白蛋白(mg/day)0.29±0.021.65±0.220.81±0.10*#注：与Ctrl组相比，P<0.01；与DN组相比，P<0.053.312-LO对空腹胰岛素水平及胰岛素敏感指数的影响与Ctrl组比较，DN组大鼠空腹胰岛素水平明显增高（P<0.01），但CDC处理后空腹胰岛素水平明显下降，与DN组大鼠比较差异有统计学意义（P<0.05），见表3.3。与Ctrl组比较，DN组大鼠胰岛素敏感指数明显降低（P<0.01），但CDC处理后胰岛素敏感指数明显增高，与DN组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表3.3。表3.3各组大鼠空腹胰岛素水平及胰岛素敏感指数（x±s）CtrlDNCDC空腹胰岛素*#25.49±8.6865.57±20.5145.82±17.56（mU/L）*#胰岛素敏感指数-4.50±0.45-7.65±0.34-5.86±0.53*#注：与Ctrl组相比，P<0.01；与DN组相比，P<0.0515 3.412-LO对AMPK的影响与Ctrl组比较,DN组大鼠骨骼肌p-AMPK明显降低（P<0.01），经过CDC处理后p-AMPK基本恢复至正常水平（P<0.05），见图3.4。CtrlDNCDCp-AMPKAMPK图3.4大鼠骨骼肌中AMPK,p-AMPK的WesternBlot结果16 第4章讨论研究表明在invivo和invitro实验中12-LO可以通过激活p38MAPK通路影响RAS系统，从而参与DN的病理生理过程，引起[10,37,46]MAU、肾小球肥大和细胞外基质积聚等。DN时通过抑制12-LO延缓MAU的机制还不十分清楚。研究发现抑制12-LO可以延缓2型糖尿病大鼠MAU的进展，但是却不能抑制1型糖尿病MAU的进展[16][5,20-23]，AT1R在2型糖尿病肾小球内表达增加，在1型糖尿病肾小[24-28]球内表达无增加。之前的研究表明抑制12-LO不仅降低2型糖尿[5]病肾小球内AT1R的表达，而且延缓MAU进展。既然12-LO可以降低2型DN肾小球内AT1R的表达及MAU，且IR贯穿于2型糖尿病发生、发展的整个过程，那么我们有理由设想12-LO通过与IR的相互作用影响AT1R来参与MAU的发生、发展。为证明12-LO可以直接影响IR，本研究探讨了12-LO对反映IR的指标：即空腹胰岛素水平、胰岛素敏感指数以及AMPK的影响。胰岛素水平的测定采取国内外通用的高灵敏度和特异性的放射免疫[38]分析法，然而胰岛素水平仅仅是判断机体胰岛素分泌缺陷作用低下的基础，且空腹胰岛素只反映了胰岛素的基础分泌，并未反映进餐后[39]胰岛素的应激性分泌状态，因此本研究还采用胰岛素敏感指数来评估机体胰岛素敏感性。目前国内外对胰岛素敏感指数的测定方法还未[40]形成统一的标准，常用的方法有葡萄糖胰岛素钳夹技术、最小模型[40][41][42]技术、HomaModel公式和基础状态法。本研究采取基础状态法计算胰岛素敏感指数，具体计算方法为ISI=1/[空腹血糖×空腹胰岛素],取其自然对数使之正态化后进行分析。AMPK是一种异源三聚体蛋白，由α、β和γ三个亚单位组成。17 ，Hardie的研究发现，5-AMP和上游激酶可以使这种激酶变构激活，[43]故将其正式命名为腺苷酸激活蛋白激酶。AMPK是一种超灵敏的细胞能量感受器，AMPK主要通过AMP/ATP的比值进行活性调节，同时还受到上游激酶LKB1、TAK1和CaMKK调节。另外，AMPK还受到多种激素和细胞因子的调节，如瘦素、脂联素和抵抗素等。AMPK通过开启分解代谢和关闭合成代谢来维持代谢平衡和能量稳态。AMPK的活化形式是磷酸化AMPK,这需要磷酸化α亚单位活化172区域的苏氨酸残基Thr。诸多研究均已表明AMPK是已公认的与IR有关的组织内分子生物标志物之一，AMPK的活化形式，即p-AMPK[44,45]在IR病人脂肪组织中降低。12-LO与2型糖尿病时MAU的发生、发展有关，却与1型糖尿[16]病时MAU的发生、发展无关。众所周知，1型和2型糖尿病的重要区别是IR，因此12-LO可能通过影响IR来参与MAU的发生发展。为了证明12-LO通过影响IR作用于AT1R，参与MAU的假设，本研究采用CDC处理DN大鼠，并主要观察MAU、AT1R蛋白表达、空腹胰岛素水平、胰岛素敏感指数和p-AMPK的变化。本研究发现，DN组血糖、肾重/体重和MAU明显高于Ctrl组，但CDC处理后肾重/体重、MAU明显低于DN组，证明抑制12-LO对于延缓DN有效。与Ctrl组相比，DN组大鼠胰岛素水平升高，空腹胰岛素敏感指数和p-AMPK降低，说明大鼠已经处于IR状态；而经过CDC处理后，大鼠空腹胰岛素水平降低，胰岛素敏感指数升高，p-AMPK基本恢复至正常水平，证明了CDC处理有效，抑制12-LO可以改善IR，降低MAU，延缓DN。与对照组足细胞相比，12(S)-HETE和胰岛素均可以诱导足细胞AT1R蛋白表达明显增加，说明12-LO和高浓度胰岛素均可以使AT1R表达增多。在2型DN状态下，12-LO表达和胰18 岛素水平均增多。我们有理由相信2型DN中12-LO与IR相互作用使AT1R增加，而足细胞在12(S)-HETE和胰岛素联合刺激下AT1R蛋白表达较12(S)-HETE组和胰岛素组增加，侧面印证了12-LO与IR相互影响可以使AT1R表达增加的观点。值得引起注意的是，RAS系统与胰岛素敏感性可以相互影响，AT1R拮抗剂可以增强胰岛素敏感性，在2型DN时抑制12-LO可以降低胰岛素水平，增加胰岛素敏感性，改善IR状态，从而有利于延缓T2DM及2型DN的进展。这些结果验证了之前的假设，即抑制12-LO可以改善IR，降低AT1R表达，从而降低MAU。总之，12-LO与2型糖尿病IR的发生、发展密切相关，2型DN时12-LO和IR的相互作用所诱导的AT1R表达增加是促进MAU发生、发展的重要原因。因此，抑制12-LO对于延缓2型DN的进展具有重要意义。19 第5章结论1.通过细胞实验和动物实验，可得出以下结论。（1）12-LO与2型糖尿病IR的发生、发展密切相关，抑制12-LO活性可改善与IR的相关指标：降低空腹胰岛素水平，提高胰岛素敏感指数，恢复p-AMPK至正常水平。（2）12-LO可能通过影响IR的途径作用于AT1R，从而促进2型DN蛋白尿的进展。2.创新点：本研究阐明了12-LO可能通过影响IR的途径作用于AT1R，从而促进2型DN蛋白尿的进展，从而明确了DN时12-LO—IR—AT1R—MAU之间的关系。20 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