玫瑰孢链霉菌代谢达托霉素及豪氏变形杆菌铜抗性的蛋白质组学研究.docx

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1、玫瑰孢链霉菌代谢达托霉素及豪氏变形杆菌铜抗性的蛋白质组学研究蛋白质组学作为一门新兴学科,其发展迅速、应用领域越来越广泛。本研究以蛋白质组学技术为核心手段,对玫瑰孢链霉菌生产达托霉素的机理及豪氏变形杆菌的抗铜机制展开研究,试图从蛋白调控水平阐释其机理。经研究发现玫瑰孢链霉菌生产达托霉素需要前体添加物的刺激,前体是达托霉素合成的必要条件。本文针对以癸酸和癸酸钠为前体,其中前者是目前很多报道中很常见的前体,而后者则尚未任何文献有相关报道。实验结果表明癸酸钠作为前体添加的效果要明显优于癸酸,这主要是由于其具有较好的水溶性,

2、较易被细胞吸收利用。本研究首次从蛋白入手对玫瑰孢链霉菌进行分析,并阐释其代谢机理。正因为前体对达托霉素的生产起着至关重要的作用,为了进一步了解前体刺激达托霉素合成的机理,本研究试图用蛋白质组学技术加以说明。实验中,对添加前体和不添加前体两组比较分析其一维蛋白质电泳(SDS-PAGE)、串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)和液质联用质谱(LC-MS/MS)的结果。在一维蛋白电泳偶联质谱分析结果中鉴定出假定调节蛋白(Putativeregulatoryprotein)、鸟苷五磷酸合成酶(Guanosinepent

3、aphosphatesynthetase)、多核苷酸磷酸化酶(Polyribonucleotidenucleotidyltransferasephosphorylase,PNPase)、假定三肽氨基肽酶(Putativesecretedtripeptidylaminopeptidase)、假定双组份系统组氨酸激酶(Putativetwo-componentsystemhistidinekinase)这五个蛋白,它们与达托霉素的合成及分泌有密切关联。随后,本研究采取LC-MS/MS分析前体影响下的玫瑰孢链霉菌全蛋白质

4、组学,在加前体和不加前体的条件下分别鉴定出601和935个蛋白,其中差异蛋白数为357和691。实验中对这些蛋白进行了分子量和等电点的区段划分,并且模拟了双向电泳图谱。根据功能作用的区别,差异蛋白被分成了14个类别,其中转运及膜功能蛋白(transport/membranefunction)差别最大,其在添加前体实验组中占12.4%,但在不添加前体实验组中只占了5.2%。最后,结合达托霉素合成基因簇信息,在差异蛋白中发现了5类与达托霉素合成相关的蛋白,分别为抗性蛋白(resistanceprotein)、AT

5、P结合盒式转运蛋白(ATP-bindingcassettetransporter,ABCtransporter)、酰基载体蛋白(acylcarrierprotein)、甲基转移酶(methyltransferase)和调节蛋白(regulator),而且在加前体条件下较不加前体多。但在这些蛋白中并没有直接合成达托霉素的多肽合成酶,根据结果推测前体是通过影响达托霉素合成调节蛋白来促进达托霉素的合成。另外,本文运用一维蛋白电泳、二维蛋白电泳及LC-MS/MS阐释豪氏变形杆菌的抗铜机制。实验发现,铜的添加使

6、得豪氏变形杆菌的膜蛋白变多,这可能与建立抗铜性的RND系统关联。另外,在豪氏变形杆菌中存在二硫键异构酶,它能修复铜破坏的二硫键,使细胞能持续存活。而且铜使得豪氏变形杆菌的外膜通道蛋白表达受到抑制,从而减少铜向细胞内的运输,维持细胞内铜含量的正常水平,使豪氏变形杆菌在高浓度铜条件下依然能存活,但因为其泳动能力下降,故抗铜机制亦能利用在抑制其致病性上。