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1、连翘DNA条形码及叶绿体基因组超级条形码的研究连翘是唇形目木犀科连翘属植物连翘(Forsythiasuspensa(Thunb.)Vah1)的干燥果实,具有丰富的药用价值,其中的有效成分可抗炎症和抗病毒。由于其重要的经济价值及药用价值,需求量逐渐增大。目前市场中连翘资源鱼龙混杂,传统的鉴定方法具有一定局限性,因此需要一种强有力的技术手段实现连翘道地性及近缘种的鉴别。DNA条形码是由Hebert于2003年首次提出的一种物种鉴定方法。此方法简便快捷,准确度高,可对大量样品进行有效鉴定。本研究采取高盐-低
2、pH法对18个产地连翘及其混伪品进行了基因组DNA的提取,通过PCR的方法扩增出各样本的ITS2、psb-trnH、rbcL、ycf5及matK序列,并通过PCR扩增成功率、变异位点及进化树评价条形码鉴定效率。具体结果如下:1、采用高盐低-pH法成功提取了18个产地连翘及其混伪品基因组DNA。2、参照陈士林课题组公布的候选条形码引物序列及扩增条件,分别扩增出18个产地连翘及其混伪品ITS2、matK、ycf5、rbcL、psb-trnH序列,产物条带单一且明亮,扩增率均达到100%。3、使用MEGA6
3、.0软件对不同产地连翘及其混伪品进行序列比对及变异位点分析,不同产地连翘psb-trnH序列变异位点最多,rbcL序列无变异位点;在连翘混伪品鉴定中,ITS2序列变异位点最多,rbcL序列变异位点最少。4、基于ITS2、rbcl、ycf5、matK、psb-trnH五种序列构建NJ树,不同产地连翘及其混伪品共分为三大组。其中不同产地连翘为一组,连翘属中的金钟花及东北连翘为一组,紫丁香独为一组,且5个条形码合并后可成功区分10个不同产地连翘。与核基因组和线粒体基因组相比,叶绿体基因组在对植物亲缘关系的分
4、析中具有较大优势。本研究筛选出提取连翘叶绿体DNA最适方法,对山西泽州和陕西潼关连翘基因组DNA进行高通量测序,筛选出连翘叶绿体基因组序列后,绘制出叶绿体基因组图谱。并分析叶绿体基因组结构特点及两种连翘的结构差异,找出SSR位点,与唇形目4个物种叶绿体基因组基本特征及IR边区进行比较,依据68个共有蛋白编码基因对木犀科构建MP及ML系统进化树。主要结果如下:1、采用蔗糖密度梯度离心法、高盐低pH法、改良高盐-低pH法及DNaseⅠ法分别提取连翘叶绿体DNA。结果表明,改良高盐低pH法提取的叶绿体DNA
5、质量较好,叶绿体完整且数量较多,是连翘叶绿体DNA的最适提取方法。2、对连翘基因组测序后,筛选出的叶绿体基因组序列,经拼接及补洞后进行结构分析。结果表明:山西泽州连翘叶绿体基因组长度为156404bp,IR区长为25717bp,LSC区长87159bp,SSC区长17761bp。陕西潼关连翘长度为156378bp,IR区为25707bp,LSC区为87130bp,SSC区为17834bp。连翘叶绿体基因组共含113个基因,其中包括30个tRNA,4个rRNA和79个编码基因。3、对山西泽州、陕西潼关连
6、翘与唇形目4个物种进行IR边区比较。结果表明,所有物种在IR与SSC的边界区域均存在ycf1假基因,丹参、油橄榄、山西泽州及陕西潼关连翘的ycf1与ndhF基因存在重叠现象,LCS区中均存在trnH基因,与IR/SSC边界相距10-23bp不等。5、选取木犀科三个属10个样本叶绿体基因组,并基于68个共有蛋白编码基因进行MP及ML进化树的构建。结果表明,MP树将连翘、油橄榄、迎春花分为三个大组,可成功区分木犀科中三个属的各个物种。综上所述,基于ITS2、psb-trnH、rbcL、ycf5及matK组
7、合序列可区分10个产地连翘,并可成功区分连翘及其混伪品。此外,依据连翘叶绿体基因组测序结果,分析得出叶绿体基因组可成功区分木犀科各个物种,充分证明了叶绿体基因组作为超级条形码在鉴定物种中具有的较大潜力。果果果
