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1、牛磺酸抗骨关节炎的作用及机制研究研究背景:骨关节炎(OA)是一种慢性退行性疾病,发生于中老年人。肿胀,畸形和关节功能障碍影响了世界上的许多患者,并且是人类残疾和丧失能力的主要原因之一。随着人类寿命逐渐延长以及生活方式的改变,骨关节炎患者人口数量日益增长,全球65岁以上人群有超过一半为膝关节炎患者,到2020年,据估计骨关节炎成为世界上第四大常见疾病。我国中老年人症状性膝骨关节炎的患病率为8.8%,每10万人口中由于膝骨关节炎所导致的“伤残损失生命年”约为968人年,在所有疾病中排名第10位。在给患者带来巨大身心痛苦的同时,也引发社会产生沉重经济负担。这种疾病特点是逐渐加重的关节的损伤和退化,以
2、关节软骨的破坏为主要表现。软骨细胞是关节软骨中的唯一细胞,软骨细胞可以产生并维持主要由胶原蛋白和蛋白多糖组成的关节软骨基质,负责维持人和动物的软骨和关节健康。大量研究表明,细胞凋亡导致的软骨细胞损失增加是骨关节炎的一个主要特征。随着骨关节炎患者的病情逐渐发展,软骨细胞出现大量死亡,并且软骨细胞凋亡是关节软骨中细胞逐渐减少的主要原因。所有这些变化导致关节软骨不可逆转的进行性退化。内质网应激(EndoplasmicReticulumStress,ERS)是一种亚细胞病理过程,是由于内质网功能发生了紊乱。它反映了内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质的负载与内质网的蛋白处理能力之间的不平衡。ERS参与许多
3、疾病的病理过程,最近的研究表明,随着OA的进展,内质网应激贯穿于诸多引起软骨细胞凋亡的信号传导通路之中。牛磺酸是含硫的游离氨基酸。近年来,已发现它具有广泛的生物学效应,例如免疫调节和抗脂质过氧化损伤。牛磺酸是一种内源性抗氧化剂,对心肌细胞,神经细胞,平滑肌细胞和肿瘤细胞等细胞的凋亡有重要作用,对细胞有一定的保护作用。然而,没有研究检查牛磺酸对人软骨细胞的保护作用。因此,我们假设牛磺酸治疗可以通过减轻内质网应激,减少软骨细胞凋亡,保护软骨细胞,从而起到保护关节软骨和减缓骨关节炎的发展的作用。研究目的:1.探讨牛磺酸对大鼠骨关节炎模型的治疗作用,并探讨其相关机制。2.探讨牛磺酸对人骨关节炎软骨细胞
4、内质网应激的影响,探讨其对骨关节炎影响的机制。研究方法:第一部分:1.通过前交叉韧带切除术和内侧半月板切除术建立大鼠骨关节炎模型。2.采用尾静脉注射的方法给予不同浓度(100mg/kg;200mg/kg;400mg/kg)的牛磺酸处理。3.在手术前和手术后每两周评估骨关节炎发展情况及牛磺酸作用影响。4.应用双通道重量传感器测量大鼠后肢的体重分配,测定关节负重疼痛引起的大鼠后肢负重姿态变化。5.应用VonFreyFilaments刺激大鼠后肢收缩反应,测定继发性机械性异位疼痛程度。6.测量膝关节的宽度以反映膝关节的肿胀程度。7.在第14周,进行膝关节软骨的组织病理学分析,观察软骨损伤及骨关节炎发
5、展情况。8.通过蛋白质印迹技术评估MMP-3和CHOP的蛋白质表达水平。第二部分:1.取样骨关节炎软骨组织。提取软骨组织RNA,通过qRT-PCR定量软骨中Ⅱ型胶原(collagenⅡ)和内质网应激及细胞凋亡标志物(GRP78、GADD153和Caspase-12)的mRNA表达水平。2.通过蛋白质印迹技术测定软骨组织蛋白,检测软骨中的Ⅱ型胶原(胶原蛋白Ⅱ)和内质网应激、细胞凋亡标志物(GRP78、GADD153和Caspase-12)的蛋白表达水平。3.培养关节软骨细胞,H202和牛磺酸梯度实验,通过细胞计数试剂盒CCK-8评估软骨细胞的细胞活力,确定诱导内质网应激和牛磺酸治疗的培养条件。4
6、.分三组培养软骨细胞:①空白对照组;②0.3mMH2O2处理诱发ERstress组③25mM牛磺酸预培养后0.3mMH2O2处理组。5.细胞计数试剂盒CCK-8评估软骨细胞的细胞活力,AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡。6.通过蛋白质印迹技术评估软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白、内质网应激和凋亡标志物(GRP78、GADD153和Caspase-12)的蛋白质表达水平。研究结果:第一部分:1.大鼠骨关节炎模型建立前交叉韧带切断术(anteriorcruciateligamenttransaction,ACLT)加内侧半月板切除术(medialmeniscusresection,
7、MMx)可迅速诱发大鼠骨关节炎。手术建模后的疾病进程更快且更为连贯,很好的模拟了骨关节炎发病的力学及生物学特性。2.牛磺酸治疗可以减轻大鼠骨关节炎模型的症状在继发性异位疼痛评估测试中,与OA组相比,牛磺酸治疗组的缩爪潜伏期显著增加。在使用牛磺酸治疗6周后,OA+1X牛磺酸组(1.25±0.12g,p<0.05)、OA+2X牛磺酸组(1.6±0.1g,p<0.01)与OA组相比缩爪潜伏期
