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1、当归多糖治疗代谢综合征相关疾病的作用及机制研究当归是我们祖国传统中药,已有上千年的使用历史。中医里的当归是我国甘肃岷县道地药材伞形科多年生草本植物当归(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)的根茎干燥而成,常用于补血活血和调经止痛。当归多糖(Angelicasinensispolysaccharide)分离自当归根饮片,具有显著的药理活性,是当归中的发挥药理功效的主要成分之一。现代医学研究表明当归多糖具有抗氧化、免疫调节、抗贫血、抗炎、调节糖脂代谢紊乱等药理作用。本课题旨在明确当归多糖对代谢综合征相关疾病,即2型糖
2、尿病(T2DM)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)和酒精性脂肪肝(AFLD)的治疗作用及具体机制。本论文以岷县当归根饮片为原料,沿用课题组已建立的工艺,采用水提醇沉法提取得到当归多糖并通过一系列手段进行质量评价。体内建立T2DM、NAFLD和AFLD小鼠模型,体外建立胰岛素抵抗细胞模型、脂肪变性细胞模型和酒精性脂肪肝细胞模型,并用当归多糖对小鼠灌胃治疗或与细胞共培养,通过一系列手段评价当归多糖的治疗效果并研究分子机制。本课题不仅明确了当归多糖治疗代谢综合征相关疾病的作用和具体机制,为其临床应用奠定理论基础;还为代谢综合征的药物治疗提供更多
3、依据,对提高人民生活质量起到积极作用,并有助于祖国医药的传承与发扬。第一部分当归多糖的提取、纯化与鉴定制备当归多糖沿用本实验室已建立并优化过的工艺:首先采用水提醇沉法提取当归粗多糖,之后依次用反复冻融除杂,用0.8μm和0.45ltm微孔滤膜除杂,Mw3500透析袋除杂,再放入真空冷冻干燥机直至出现白色絮状当归多糖。随后采用葡聚糖凝胶G50色谱分离柱分离提纯得到精制当归多糖。对提取的当归多糖进行结构鉴定和质量控制:硫酸苯酚法测得当归多糖糖含量大于90%,HPGPC法测得当归多糖重均分子量为72900Da,紫外扫描显示当归多糖中几乎不含
4、核酸和蛋白质,红外扫描明确了多糖的特征吸收峰,单糖分析表明当归多糖主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成,比例为1:2.5:7.5。该部分实验证明提取的当归多糖纯度高、分子量均一、几乎不含杂质;实验易于重复,条件可控,结果稳定,提取的当归多糖可用于后续药理学研究。第二部分当归多糖治疗T2DM的作用及机制研究我国T2DM患者众多,严重影响人民健康水平,而目前临床上治疗糖尿病化学药物大都靶点单一,副作用明显。而当归多糖毒副作用小,药理作用强,本部分研究旨在明确当归多糖对T2DM的治疗作用,为当归多糖的临床应用提供理论依据。我们在研究中利用高热
5、量饮食长期喂养小鼠,外加注射链脲佐菌素(STZ)破坏胰岛β细胞建立T2DM小鼠模型,再用当归多糖灌胃治疗四周。实验中定期监测小鼠体重和空腹血糖浓度(FBG);治疗结束后进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT),检测小鼠肝重指数、糖化血红蛋白(HbA1c)含量、血清TC、血清TG、血清HDL-c、血清LDL-c、血清ALT、血清AST和肝糖原含量;检测血清胰岛素、葡糖激酶(GK)和葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)水平;制作组织切片,观察胰岛H&E染色切片和肝脏油红O染色切片;WB法检测小鼠肝脏胰岛素通路相关蛋白IRS-2、PI3K、Akt、p-
6、Akt和GLUT2。另外,为明确当归多糖对胰岛素通路的刺激作用,我们还建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型,当归多糖培养后检测细胞中p-IRβ、p-IRS1、p-IPI3K和p-Akt含量,观察当归多糖对胰岛素通路的调控作用。实验过程中,T2DM小鼠出现“三多一少”的症状,即多饮、多尿、多食和体重减轻。当归多糖对减少的体重没有影响,但是可以降低T2DM小鼠升高的肝重指数。T2DM小鼠FBG和HbA1c明显升高,超过11.1mmol/L,葡萄糖耐受力显著降低;当归多糖治疗后T2DM小鼠血糖显著降低,葡萄糖耐受力明显提升。此外,T2DM小鼠出
7、现了明显的血脂紊乱和肝损伤(ALT和AST水平提高),当归多糖可以明显调控这些生物标志物更趋于正常水平。组织学观察表明T2DM小鼠胰岛严重损坏,当归多糖可适度修复胰岛;肝脏油红O切片显示T2DM小鼠肝脏有大量脂肪堆积,同样,当归多糖可适度缓解脂肪肝。值得注意的是,当归多糖可以大幅度提高小鼠血清胰岛素水平,提示我们当归多糖可能对胰岛素通路有独特的作用。WB法检测小鼠肝脏胰岛素通路相关蛋白,结果表明当归多糖可显著提高通路关键蛋白的表达量,提示当归多糖可能对胰岛素通路有刺激作用,从而发挥降血糖作用。为进一步明确该作用,我们建立胰岛素抵抗细胞
8、模型并用当归多糖干预培养;当归多糖介入后,细胞中胰岛素通路关键蛋白可明显上调,而PI3K抑制剂LY294002可以抵消当归多糖的这一作用,再次证明当归多糖可上调胰岛素通路。另一方面,当归多糖可提高小鼠肝糖原含量,并上调糖
