凝胶色谱技术-教案.docx

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1、药品生产技术专业教学资源库-《药物分离与纯化技术》离子交换技术教案授课章节名称凝胶色谱技术授课形式讲授1.知识内容及要求了解色谱技术分类与各类色谱技术；熟悉凝胶色谱的基本原理和方法。教学目的与要求2.技能内容及要求能独立完成凝胶色谱纯化的具体操作；能掌握凝胶色谱设备的操作流程。教学重点、难点重点：凝胶色谱；色谱分离中凝胶的分类；柱色谱凝胶的选择；凝胶柱色谱的操作难点：凝胶柱色谱的操作教学方法讲授法、发现法、提问讨论法；多媒体辅助教学。1凝胶色谱2色谱分离中凝胶的分类教学内容3柱色谱凝胶的选择4凝胶柱色谱的操作凝胶层析常被称为凝胶过滤色谱（Gelfiltrat

2、ionchromatography,GFC），有时也叫凝胶渗透色谱（Gelpenetrationchromatography,GPC），是利用凝胶粒子为固定相并具有网状结构，根据样品的分子大小进行分离的一种层析方法。是含有尺寸大小不同分子的样品进入层析柱后，较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部，较早的流出层析柱。较小的分子可以通过部分孔道，更小的分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子向柱下方移动速度最慢，中等分子次之，样品根据分子大小的不同依次顺序从层析柱内流出而达到分离的目的。凝胶介质像分子筛一样，将大小不同的分子进行分离

3、，因而又叫体积排阻色谱（Sizeexcludingchromatography,SEC）。图1凝胶层析法的原理1分子大小不同混合物上柱；2洗脱开始：3小分子扩散进入凝胶颗粒内，药品生产技术专业教学资源库-《药物分离与纯化技术》离子交换技术教案大分子则被排阻于颗粒之外；4尺寸不同的大小分子分开；5大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中一、色谱分离中凝胶的分类1交联葡聚糖凝胶葡聚糖商品凝胶牌号为：Sephadex。它是以环氧氯丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶。交联程度决定凝胶孔结构，依据孔径不同形成G型凝胶的系列产品。G后面的数字越大表示孔径越大，排阻极限也

4、越大。粗颗粒（Coarse）流速较快，细颗粒（Fine）流速较慢。随着凝胶介质的发展，已逐渐被新一代的BioProcess凝胶所取代。在葡聚糖结构中引入羟丙基就成为SephadexLH系列产品。以G-25为母体的衍生物为LH20，以G-50为母体则为LH60。改性后，LH系介质具有更加广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其它小分子的分级分离。这类介质除水溶液外，还适用于极性有机溶剂及水-有机溶剂的混合溶液体系。该介质结合凝胶过滤、分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构非常相近的分子。载量可达300mg/ml凝胶，极少需要重生，分离效果可以保持数十

5、年不变。2琼脂糖凝胶该系凝胶都是由经过纯化的琼脂糖制备的，其中仅含有极少的带电基团传统的琼脂糖凝胶，非特异性吸附极低，分离范围很广，可从10000～40000000，所以它适用于分子量差距较大的分子间分离，分辨率不很高。琼脂糖系凝胶分别为：2.1）Bio-GelA系是美国BioRad公司的产品，为交联琼脂糖凝胶，适用pH值范围4～13。2.2）Sepharose系是目前生化分离专用介质中型号最多、应用最广的最大系列产品,机械强度较低。SepharoseCL是利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶，机械强度较普通Sepharose高。2.3）Sup

6、erdex系该系列产品也是BioProcess介质中的一种。Superdex凝胶是将葡聚糖共价交联到高度交联的琼脂糖珠体上制备的刚性凝胶，具有葡聚糖及琼脂糖均匀组分的骨架结构，因此将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身，成为目前选择性、分辨率最高的凝胶过滤介质，流速快而反压低。2.4）Superose系Superose是经过二次交联制备的刚性琼脂糖凝胶，该系列产品具有宽广的分离范围并配合高分辨率，能一次性分离生物分子大小差异大的混合物。该系列产品刚性好，在高粘性液体下也能保持流速，适合糖类、核酸，病毒，特别是包涵体蛋白在促溶剂中的

7、纯化。凝胶寿命特别长。3聚丙烯酰胺凝胶这类介质的商品型号为Biogel-P，是由丙稀酰胺与N,N’亚-甲基双丙稀酰胺共聚而成的一类亲水性凝胶，其中含有极少的游离电荷，干胶的羧基含量≤3.0mmol/g，因此吸附特异性很小。这类合成高聚物结构稳定，不受微生物侵蚀，可在120℃消毒30min后，色谱性能不变。改变交联剂的用量可控制凝胶孔径的大小，得到不同排阻极限的产品。二、柱色谱凝胶的选择根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-200的吸水量为20，1克SephadexG-200吸水后形成的凝胶

8、体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析