色谱分离技术凝胶筛分

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1、色层分离技术色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。惯用法按固定相的基质（载体）类型分类：层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。也有人将层析称为色谱。用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。色层分离原理当两相作相对移动时，利用溶质在互不相溶的两相中吸附或分配的差异，引起移动速度的不同而进行分离的方法。分类流动相与固定相：流动相：可为气相、液相、超临界流体等固定相：固体、液体和以固体为载体的液体

2、薄层固定相的形状：纸层析薄层层析柱层析操作压力低压：﹤0.5MPa中压：0.5-4.0MPa高压：4.0-40MPa，用于分析目的分离操作模式洗脱展开：最常用前沿（迎头）分析顶替展开用于大量制备分配机理根据溶质和固定相间的作用机理凝胶过滤离子交换反相色谱疏水层析亲和色谱常规的色层分离色层分离过程包含两部分：固定相：载体或载体+功能基团流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。上样洗脱上样冲洗洗脱高压液相色谱分离操作过程层析分离操作过程液相色谱的基本原理和参数保留时间(tR)和保留体积(VR)从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用t

3、R表示。在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用VR表示。色谱流出曲线及参数容量因子k和平衡常数K某物质的k定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。而平衡常数K为平衡时，物质在两相的浓度比：Vs和Vm分别为柱内固定相和流动相所占的体积。于是有溶质在固定相停留的时间分数=溶质在流动相停留的时间分数在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度()总是小于流动相的移动速度()，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反

4、比：当柱外死体积可忽略不计时，选择性()和相对保留值()==柱效率：塔板高度（H）和塔板数（N）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。塔板高度（H）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到分配平衡，这段柱长就相当于一个理论塔板的高度(HETP或H)。理论塔板数的计算公式为：式中为标准偏差。理论塔板高度为：式中，柱长。塔板高度小，塔板数高，色谱分离效率高。影响柱效的因素1）理论塔板高度（）随填料粒度减少而减少；2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效；3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于减小；4）分子量较小的样品分子较小。凝胶过滤层析（体积排阻色谱）Gelfiltrationchromatog

5、raphy,GFCSizeexclusionchromatograpy，SEC是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大小进行分离的层析技术。应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。一般用作原料液的初分离，获取几个不同分子量物质分级，供进一步分离纯化使用。分离原理：含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出色谱柱（层析柱）。较小的分子可通过部分孔道、更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体）内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）

6、从而达到分离的目的。凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关。（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；（3）具有一定的孔径分布范围；（4）机械强度高，允许较高的操作压力。常用的分离介质天然及高分子介质经常使用的是葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶（Superdex）以及聚丙烯酰胺类和聚乙烯醇类合成凝

7、胶（TSKgel）。（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴SephadexG交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200每克干胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映凝胶的交联程度