凝胶柱色谱分离蛋白质

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1、凝胶柱色谱分离蛋白质【目的要求】1、熟悉凝胶色谱分离的基本原理；2、掌握凝胶柱色谱填充物的装柱、平衡、加样、洗脱等基本操作技术。【实验原理】凝胶色谱是利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的技术。当溶液在色谱柱内流过时，各种物质分子在柱内同时进行向下的移动和不定向的分子扩散运动。大分子物质由于分子直径大，难于进入凝胶颗粒的微孔，只能在凝胶颗粒的间隙中随流动相快速向下移动；而小分子物质能够扩散进入凝胶颗粒的微孔中，因此在流动过程中不断地进出于胶粒的微孔，这样就使小分子物质向下移动的速度落后于大分子物质，从而使溶液中的各组分按分子量从大到小的顺序先后流出色谱柱，达到

2、分离纯化的目的。【实验用品】1、材料葡聚糖凝胶SephadexG-100、蓝色葡聚糖2000、溶菌酶2、试剂（1）蓝色葡聚糖-2000（2mg/mL）和溶菌酶（6mg/mL）组成的混合液（2）0.025MKCl-0.2M乙酸缓冲液3、器具色谱柱、铁架台、试管、紫外分光光度计或紫外检测仪、电炉、容量瓶、烧杯、三角瓶、滴管、移液管、玻棒。【实验过程】凝胶溶胀：根据预计的总床体积和所用干胶的床体积，称出所需干凝胶放入大三角瓶或烧杯中，加入过量的缓冲溶液或去离子水，浸泡24h以上或沸水浴中煮沸溶胀2~3h，冷却至室温。用倾泻法将不易沉下的较细的颗粒倾去。1、凝胶柱的制备。装柱：升高或关闭色谱柱的出水

3、口，在柱内先注入约1/3柱高的缓冲液。轻轻搅动三角瓶中的凝胶（切勿搅动太快，以免空气进入），使之形成均一的凝胶浆，并立即缓慢并连续不断地沿玻棒倒入柱中，让其沉降约1~2cm高时，然后降低或打开柱的出水口，让缓冲液慢慢地流出。随着下面水的流出，上面陆续不断地添加凝胶，直至凝胶完全沉降至所需的柱高为止，然后在凝胶表面上放一片滤纸，以防将来在加样时凝胶被冲起。柱要一次装完，不能间歇，并始终保持凝胶上端有一段液体。层析分离系统2、平衡：用0.025MKCl-0.2M乙酸缓冲液流动平衡凝胶色谱柱。开始时，流速控制在低于0.5mL/min，在平衡过程中逐渐增加到色谱时的速度即3~4mL/5min，一般用

4、约2~3倍总床体积的缓冲溶液流过柱即可平衡。3、加样：吸去柱床表面以上的溶液，面上留下一些液体从柱的出口流出。等到凝胶床面上的液体正好流干时，小心地用滴管将约1mL蓝色葡聚糖和溶菌酶的混合液加到凝胶床面上。先使滴管尖端接触离柱床表面约1cm高处的内壁，随加随沿柱内壁转动一周，然后迅速移至中央，使样品尽可能快地覆盖住全胶面，打开下口，以便使样品均匀地渗入柱内，当样品液下降至与胶面相平（胶面必须覆盖一层薄薄的溶液）时，关闭下口。待其正好流干时再加少量缓冲溶液，这样滴入洗脱液时不会冲动凝胶床面。加样前，如果胶面不平整，可用玻棒将胶表层轻轻搅起，待其自然沉降至平整后，方可加样，加样过程中注意不要破坏

5、胶面的平整。4、洗脱：用0.025MKCl-0.2M乙酸缓冲液进行洗脱。流速控制在0.25mL/min。每15分钟收集一管，然后用紫外分光光度计于280nm处测定每管吸光度（A280）。洗脱过程中要注意观察蓝色区带向下移动的情况，如前沿平齐，区带均匀，说明柱是均匀的，可以使用。如不均一，必须重新装柱。以管号（或洗脱体积）为横坐标，吸光度为纵坐标作出洗脱曲线，并分辨蓝色葡聚糖-2000和溶菌酶的洗脱峰或洗脱位置。【注意事项】1、色谱柱大小可根据实际需要选择，一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生管壁效应，即柱管中心部分的组分

6、移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。2、装好的色谱柱凝胶要均匀，不能有断层或纹路或气泡，将柱管对着光照方向观察，若色谱柱床不均匀，必须重新装柱。3、各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。操作过程中，色谱柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。4、始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变差，不得不重新装柱。5、洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从而影

7、响分离效果【思考题】1、凝胶色谱分离有何特点和主要用途？2、做好本实验的关键事项主要有哪些？3、本实验中出现几个洗脱峰？哪个是溶菌酶的洗脱峰?