rnai技术与胶质瘤的治疗

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1、RNA干扰与胶质瘤的基因治疗（RNAi）内容提要摘要概述一、RNAi基本原理二、RNAi靶点设计三、RNAi实施手段四、RNAi技术优势五、RNAi在胶质瘤研究中的应用六、RNAi技术在国内的应用摘要RNA干扰（RNAi）技术是一种新兴的有外源性或内源性双链RNA介导的转录后基因沉默技术。RNAi可使目标基因低表达或完全不表达。概述RNAi现象是指外源性或内源性双链RNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能性表型缺失。（这一现象属于转录后的基因沉默机制，posttranscriptionalgenesilencin

2、g，PTGS）RNAi技术日渐广泛的用于逆基因分析和基因治疗研究一、基本原理dsRNA在细胞内被一种RNA内切酶III(RNAaseIIIendonuclease)——Dicer酶切割成21～23个碱基(nt)的核苷酸小序列-小RNA双链。小RNA双链由正义链和反义链组成RNAi效应中间产物小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。(RISC)——RNA诱导沉默复合体siRNA（+Dicer酶）↓识别靶基因mRNA↓mRNA与siRNA正义链交换↓Dicer酶+siRNA+mRNA（即RISC+mRNA）Dicer酶即可切割

3、靶基因mRNA→抑制表达二、靶点设计对于任何一个靶基因，RNAi靶点的选择都带有一定的随机性。设计时，同时要注意考虑避免DNA最常见的变异——单核苷酸多态性（SNP）的易发位点基因的稳定性是相对的错配一个碱基就可以导致siRNA失效三、RNAi实施手段（一）化学合成和体外酶法合成(早期)合成的RNA类似物导入哺乳动物细胞缺点：短暂的干扰效应（二）重组载体以DNA为模板的RNA聚合酶IIIU6和H1启子引导的表达siRNA真核表达载体→哺乳动物细胞内表达产生siRNA方式：①双启动子分别表达正义链和反义链，然后在胞内结合形成siRNA②单启动子引导19

4、nt的目的序列及其反向的重复序列来表达小发夹状RNA（smallhairpinRNA，shRNA）——RNAi效应相对更强重组载体的优点：RNAi的合成过程转移至胞内进行，效率大大提高排除RNAase的干扰，延长siRNA的半衰期pSUPER-retro能够整合到靶细胞的基因组，长期稳定地抑制基因表达，在原代细胞也能实现高效率的基因转移。pSUPER-retro(逆转录病毒载体)四、RNAi技术的优势优点：⑴逆基因分析（即通过抑制已知序列特异基因的表达，出现表型和功能型的改变进而得到基因功能信息）效率和效果远超过反义核酸技术效率和效果接近基因敲除技术

5、，又较基因敲除技术操作简单、周期短、费用低反义核酸技术基因敲除技术⑵基因治疗方面的潜能——利用基因家族高同源性保守序列起作用因为同一基因家族一般都具有高同源性的保守序列，所以①可以设计针对这一保守序列的siRNA分子，只导入一种表达siRNA载体即可产生多个基因同时切除的效果②同时导入多种表达的siRNA载体，将多个序列各异癌基因同时敲除五、RNAi在胶质瘤研究中的应用㈠siRNA干扰胶质瘤中蛋白激酶C异型的表达，利用基因芯片分析靶细胞在DNA合成、细胞凋亡、细胞间联系、细胞内信号转导和细胞表面因子等588个相关基因表达水平的改变，最终确定该蛋白激酶

6、C的一些功能。PKC㈡作用于表皮生长因子受体（EGFR）EGFR的扩增和突变在星形胶质瘤中较常见，其中缺失外显子2-7的DeltaEGFR是主要变异形式，并且DeltaEGFR在正常组织中不存在。针对DeltaEGFR特异的外显子1和外显子8交界序列的siRNA↓DeltaEGFR表达明显下降↓凋亡增加，细胞周期停滞在G2/M同时证实了DeltaEGFR作为胶质瘤治疗靶点的价值DeltaEGFR的mRNA被切割，导致其低表达或不表达→抑癌？㈢降低人类胶质瘤细胞对神经酰胺的耐药性耐药机制：凋亡蛋白抑制剂（Inhibitorsofapoptosispro

7、tein，IAPs）诱导caspase-7的抑制作用，特别是X染色体相关联的凋亡蛋白抑制剂（XIAP）的抑制作用。siRNA作用：靶向XIAP的siRNA发挥基因敲低作用，有效逆转U251SP、T98G、SKAO2和U251MG等胶质瘤细胞对神经酰胺的耐药性神经酰胺㈣影响肿瘤细胞的转移侵袭利用细胞内发夹装小RNA序列的靶向uRNA和CB重组质粒载体转染人体胶质瘤细胞后，特异性的肿瘤侵袭力和血管形成能力下降。实验中发现，对颅内预先接种的人胶质瘤瘤内注射重组RNAi质粒后瘤体也有缩小，与对照组相比较，实验组的uPAR和CB表达水平明显下降。uPARCB㈤

8、抑制肿瘤细胞的能量代谢肿瘤细胞对糖酵解具有依赖性，瘤细胞内可产生比正常细胞更多的乳酸盐。靶向MCT1和MCT