绪论3酶分离纯化ppt课件.ppt

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1、酶学彭益强Enzymology国立华侨大学生物工程与技术系一细胞破碎二酶的提取三离心分离四过滤与膜分离五沉淀分离六层析分离(link)七电泳分离(link)八萃取分离(link)九酶的结晶(link)十浓缩与干燥(link)主要内容go第五节酶的分离纯化六层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离。层析分离中一个相是固定的,称为固定相;另一个相是流动的,称为流动相;各组分移动速度步同,使不同组分分纯化;层析分离设备简单,操作容易;层析分离层析柱表4

2、-5层析分离方法层析方法　　　　　　　　　分离依据吸附层析　　　吸附力不同分配层析　　　各组分在两相中分配系数不同离子交换层析　离子交换剂上解离基团对离子亲和力不同凝胶层析　　　各组分相对分子量不同亲和层析　　　生物分子与配基间专一又可逆亲和力层析聚焦　　　等电特性与离子交换层析特性结合一、吸附层析(link)二、分配层析(link)三、离子交换层析(link)四、凝胶层析(link)五、亲和层析(link)附：视频动画1、色谱柱2、液相色谱生产上常用的层析分离方法go一、吸附层析一个相中的物质在两相界面上密集现象称为吸附；吸附产生原因：固体表面分子与固

3、体内部分子受的作用力不同；主要是范德华力。常用于酶分离纯化的：硅藻土、氯化铝、磷酸钙、羟基磷灰石、活性碳。不同物质吸附力、解析力不同，移动距离不同，而分离。利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中各组分分离。１、吸附层析原理２、洗脱方法（１）溶剂洗脱法洗脱曲线洗脱液体积物质浓度（２）置换洗脱法ＡＢ洗脱液体积物质浓度吸附层析（续）（３）前缘洗脱法ＡＡ＋ＢＡ＋Ｂ＋Ｃ洗脱液体积物质浓度３、吸附剂与洗脱剂的选择（１）吸附剂的选择极性物易被极性表面吸附；溶解度大的越难吸附；吸附剂分无机和有机吸附；用于酶分离纯化的有硅藻土、氧化铝等，在低pH值、低离子强度下对

4、酶有较强吸附作用，提高难度pH，离子强度即可洗脱。（２）洗脱剂的选择对于极性组分用极性大的溶液；注意点：洗脱剂不与吸附剂反应、对各组分溶解度大、流动性好，有一定纯度。back二、分配层析分配系数指溶质在两互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两溶剂中浓度比值。通常用一种多孔性固体支持物吸着一种溶剂为固定相。不同溶质有不同分配系数，移动速度不同，从而分离。（１）纸上层析滤纸为支持物，以滤纸纤维结合水为固定相，有机相为流动相，分配系数不同而分离。（２）薄层层析固定相支持物铺在支持板上成为薄层，有吸附薄层层析，分配薄层层析。back三、离子交换层析利用离子交

5、换上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离。酶是两性物质，当溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离，反之，用阳离子交换剂。用于酶分离纯化的常用离子交换剂离子交换树脂：大孔径离子交换树脂。离子交换纤维素：DEAE-纤维素，AE-纤维素，CMC（羧甲基纤维素）离子交换凝胶：DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶等。1、离子交换剂的处理与装柱；2、上柱；3、冼脱和收集；4、离子交换剂的再生。２、离子交换层析的主要操作过程１、离子交换剂的选择与处理是含有若干活性基团的不溶性高分子物质；引入不溶性母体的活性基团

6、可以是酸性基团，作为阳离子交换剂；也可是碱性基团，作为阴离子交换剂；平衡常数Ｋ；（１）离子交换剂的选择；（２）离子交换剂的处理。back四、凝胶层析混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。凝胶层析是60年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用。从广义上说凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的高分子聚合物，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。制成颗粒状，装进凝胶层析柱使用。设备简单

7、，操作方便（不需经过再生处理可反复使用）。不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，适于不同分子量的各种物质。凝胶颗粒McBain(1928)提出；Synge与Tiselins（1950）在解释凝胶层中的电泳和电渗现象时引用了分子筛的概念。此后发现在柱层析中也有这种现象，于是许多工作者尝试了一系列适用于生物高分子分离纯化用的分子筛。1959年Porath与Flodim将部分水解的葡聚糖凝胶交联，得到了商品名为交联葡聚糖（Sephadex)的分子筛。该分子筛具有许多良好的性能，在蛋白质的分离分析中已被广泛采用。分子筛概念凝胶是分子筛的一种１、凝胶层

8、析的基本原理凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其