酪蛋白酶谱MMP检测实验.doc

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1、酪蛋白酶谱MMP（3/10）检测实验实验技术服务方法：基质金属蛋白酶（MMP）酪蛋白酶谱法（casein-zymography）电泳分析试剂是一种旨在通过酪蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等一系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的白色清晰的基质金属蛋白酶条带，根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取样品（动物、人体、植物、昆虫等）、培养上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶－1，3，7以及12等活性及其抑制剂的检测。【晶

2、莱生物】实验技术背景：基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellularmatrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissueresorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ

3、、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。 体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随

4、后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。酪蛋白酶谱法（casein-zymography）电泳分析技术使用β－酪蛋白作为酶的底物，具有简便，无需抗体，同步观察多种酶以及活化与否的优势。酪蛋白酶谱法MMP3/10检测实验案例介绍：本实验采用酶谱法(zymography)检测MMP-3、MMP-7、MMP-10活性，Zymography是一种基于SDS-PAGE电泳的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1nM(10~100pg)，高于ELISA方法。通过制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶，含蛋白酶的样

5、品在凝胶进行电泳，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育，凝胶进行考马斯亮蓝染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能同时指示MMP-3/10的大小位置(酶谱)及活性。样品准备要求：1）血浆/血清/上清或体液样品准备：血浆或血清样本加入1/10体积的柠檬酸钠，1000rpm离心20分钟，留取上清，以BCA法测定蛋白浓度，测定浓度以后，取约30ug蛋白上样进行电泳检测。样本准备后可暂时4℃保存，不立即测定的样品需-70℃保存，但不宜超过10天。2）组

6、织样本准备：取100mg新鲜组织以2ml匀浆液进行匀浆（匀浆剂：0.1MTris/HCl/pH7.4,0.5%TritonX-100，0.1mg/mlPMSF），12000g4℃离心5分钟，移取上清层至另一新的1ml离心管待测，取30ug蛋白上样进行电泳检测。样本准备以后，样品可暂时4℃保存，不立即测定的样品需-70℃保存，但不宜超过10天。3）细胞样本准备：取1个6孔板细胞（每孔细胞量约2×106个细胞），离心后以500ul匀浆液进行超声匀浆（匀浆剂：0.1MTris/HCl/pH7.4,0.5%TritonX-100，0.1mg/mlPMSF），1

7、2000g4℃离心5分钟，移取上清层至另一新的1ml离心管待测，取30ug蛋白上样进行电泳检测。样本准备以后，样品可暂时4℃保存，不立即测定的样品需-70℃保存，但不宜超过10天。