酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP-MMP-9的活性

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1、蛋白质高级结构的预测酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性变化及其临床意义综合性设计性实验-2此实验共包括如下三个部分第一部分，蛋白质高级结构的预测第二部分，酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性变化及其临床意义第一部分，蛋白质高级结构的预测蛋白质的三维构象，也称空间结构或高级结构，是指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。高级结构是蛋白质表现其生物功能或活性所必须的。X射线晶体学方法是至今为止研究蛋白质结构最有效的

2、方法，所能达到的精度是任何其他方法所不能比拟的，它的缺点是蛋白质的晶体难以培养，晶体结构测定的周期较长。近年发展起来的多维核磁共振方法可以直接测定蛋白质在溶液中的构象，但是由于对样品的需要量大、纯度要求高，被测定的蛋白质的分子量一般不超过20000Da等原因，也受到很大限制。截至2008年6月，与迅速增长的庞大基因组核酸数据相反，已知三级结构的蛋白数量还不到6万个。（来自蛋白结构数据PDB的统计）利用蛋白质的一级结构所提供的氨基酸序列信息来进行高级结构预测的方法就是应这种需要而发展起来的。蛋白质的一级结构决定高级结构这一论点，仍然是进行蛋白质三级结构预测的理论基础。目前蛋

3、白质三级结构预测的方法有：（1）在已知结构（如晶体结构）的基础上利用分子动力学方法研究蛋白质分子、核酸分子或复合物的动态性质。（2）利用能量优化或分子动力学方法对结构模型进行优化；或者是在整体结构已知的情况下建立点突变体的结构。（3）借助于类似物的结构参数建立未知蛋白质的结构。（4）结合2D-NMR数据或X-RAY粗结构数据或其他的实验数据建立蛋白质的整体模型结构模型。（5）在上述条件均不符合的情况下，根据一级结构进行二级结构预测，准确度＜65％。（6）在已知二级结构的基础上进行片段堆积，根据从已知结构得出的一些规则进行筛选，挑选可能的结构，往往得到多种可能性，尚不能得到

4、唯一的正确堆积方式。（7）在单体结构已知的情况下，建立复合物或多聚体的结构，参考复合物或聚合物本身的性质，利用几何匹配和最大接触面积规则进行。从待测蛋白质序列出发，搜索蛋白质结构数据库（如PDB,SWISS-PROT等），得到许多相似序列（同源序列），选定其中一个（或几个）作为待测蛋白质序列的模板；待测蛋白质序列与选定的模板进行再次比对，插入各种可能的空位使两者的保守位置尽量对齐；建模：调整待测蛋白序列中主链各个原子的位置，产生与模板相同或相似的空间结构，待测蛋白质空间结构模型；利用能量最小化原理，使待测蛋白质侧链基团处于能量最小的位置。同源建模法预测蛋白质三级结构一般

5、由四步完成：SWISS-MODEL蛋白质结构预测SWISS-MODEL利用同源建模的方法实现对一段未知序列的三级结构的预测。该服务创建于1993年，开创了自动建模的先河，并且它是讫今为止应用最广泛的免费服务之一。http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.htmlFirstApproachmode(简捷模式）这种模式提供一个简捷的用户介面：用户只需要输入一条氨基酸序列，服务器就会自动选择合适的模板。如果一条模板与提交的目标序列相似度大于25%，建模程序就会自动开始运行，结果以Email形式返回。常用观看蛋白三级结构的软件RasMol

6、WPDBCn3D第二部分，酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性常见电泳技术按支持介质的不同可分为：纸电泳（Paperelectrophorisis）醋酸纤维薄膜电泳（CelluloseAcetateelectrophoresis）琼脂凝胶电泳（AgarGelelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGel-electrophoresis）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）按支持介质形状不同可它为：薄层电泳板电泳柱电泳电泳设备垂直电泳系统水平电泳系统聚丙烯酰胺凝胶

7、电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺(N,N′-methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O3，简称AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophores