冰冻切片基质金属蛋白酶-9原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒产

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1、冰冻切片基质金属蛋白酶-9原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒产品说明书（中文版）主要用途冰冻切片基质金属蛋白酶-9（MMP-9）原位明胶酶谱法（insituzymography）荧光染色试剂是一种旨在通过异硫氰酸荧光素标记的明胶作为底物，在特定抑制剂存在的情况下，针对未固定处理的冰冻切片予以染色处理，基质金属蛋白酶-9切离底物产生高度绿色荧光，来定位组织中的基质金属蛋白酶-9活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种冰冻动物组织的基质金属蛋白酶-9的分析。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，荧光清晰，重复性好。

2、技术背景基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellularmatrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissueresorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

3、、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被

4、多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-9，又称明胶酶B（gelatinase-B）或IV型胶原酶（typeIVcollagenase），其前体分子量为92kDa，激活后分子量为82kDa以及更小。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白（collagens）、纤维连接蛋白（fibronectin）、弹性纤维蛋白（elastin）、层粘连蛋白（laminin）、前体肿瘤坏死因子-α（pro-TNF-α）和白细胞介素及其受体。基质金属蛋白酶-9与肿瘤发展与转移、血管形成、斑秃（alope

5、cia）等疾病有关。原位明胶酶谱法荧光染色（in-situfluorescencezymography）技术在于提高基质金属蛋白酶检测的敏感性，使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的明胶作为底物，在基质金属蛋白酶-2特异性抑制剂OA-Hy存在的情况下，经过基质金属蛋白酶-9水解后产生荧光多肽，据此在荧光显微镜下检测基质金属蛋白酶-9的活性和位置。产品内容胶体液（ReagentA）毫升底物液（ReagentB）微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，底物液（ReagentB），严格避免光照，有效保证6月用户自备3复染液（GMS40049）：用

6、于样品复染1.5毫升离心管：用于染色工作液配制的容器盖玻片：用于样品孵育处理微波炉：用于融化试剂恒温水槽或培养箱：用于试剂温育或孵育反应物荧光显微镜：用于样品染色后观察实验步骤实验开始前，准备好10张10微米厚的冰冻切片。同时室温下融化预热染色液（ReagentB），避免光照。然后进行下列操作。1．将胶体液（ReagentA）置于微波炉里加热溶化（注意：避免溢出或干枯）2．小心移取xx微升胶体液（ReagentA）到1.5毫升离心管3．放进37℃恒温水槽孵育10分钟4．同时瞬间37℃预热染色液（ReagentB）5．加入xx微升37℃预热的染色液

7、（ReagentB），混匀6．（选择步骤）加入1微升用户自备的复染液7．即刻分别加上40微升上述液体到未固定的冰冻切片的样品上8．盖上盖玻片（注意：避免气泡）9．放进4℃冰箱里孵育10分钟，或直至胶体凝结，避免光照10．放进37℃培养箱里孵育60分钟，避免光照11．即刻在荧光显微镜下观察：激发波长480nm，散发波长530nm――绿色荧光增强，表明基质金属蛋白酶-9活性高注意事项1．本产品为20次操作2．操作时，须戴手套3．样品准备要点如下：a)冰冻切片须在8至10微米厚，且未予固定处理b)样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂以及巯

8、基乙醇和DTT等c)样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOLINHIBITOR）d)如果验证样品中基质金属蛋白酶，可以使用EDTA或抑制剂预